陽(yáng)離子脂質(zhì)體和慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs的比較研究.pdf

1、干細(xì)胞療法為組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)開(kāi)辟了新的道路。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種重要的成體干細(xì)胞，具有自我更新的特性，并且具有向多種細(xì)胞分化的能力，例如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。由于這些內(nèi)在的特性，MSCs被認(rèn)為再生醫(yī)學(xué)的理想細(xì)胞來(lái)源。但是，體外的培養(yǎng)條件以及細(xì)胞培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)會(huì)影響MSCs的多潛能性和表型。為了解決這些問(wèn)題并增加治療的成功率，MSCs的基因修飾開(kāi)始成為新的研究途徑。各種

2、各樣的病毒以及非病毒轉(zhuǎn)染方法不斷進(jìn)行優(yōu)化，目的都是使目的基因理想表達(dá)。病毒載體的轉(zhuǎn)染方法具有較高的轉(zhuǎn)染率和較長(zhǎng)時(shí)間的基因表達(dá)，但是缺點(diǎn)也比較明顯，例如細(xì)胞毒性、免疫原性、致癌性、低細(xì)胞特異性、價(jià)格昂貴以及無(wú)法轉(zhuǎn)染較長(zhǎng)基因序列等。非病毒載體的轉(zhuǎn)染方法雖然轉(zhuǎn)染率較低，基因表達(dá)時(shí)間較短，然而，具有安全、可轉(zhuǎn)染長(zhǎng)基因序列、低毒性、易操作、可通過(guò)組織或細(xì)胞特異性配體的修飾來(lái)操控靶基因的運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)?；蛐揎椀腗SCs使干細(xì)胞治療的優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步提升。通

3、過(guò)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的基因，可以誘導(dǎo)MSCs向特定細(xì)胞系分化。在基因修飾后，MSCs同樣可以成為基因或藥物的載體。而且經(jīng)過(guò)基因修飾的MSCs無(wú)論在體內(nèi)還是體外都可以使用熒光蛋白來(lái)定位。所以，基因修飾成為了研究分子生物學(xué)機(jī)制的有力工具，從而促進(jìn)了MSCs在臨床中的應(yīng)用。
　　目的:
　　1.通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體載體介導(dǎo)GFP基因感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，探索非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，獲得最佳陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA比。
　　2.通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)G

4、FP基因感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，探索慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，獲得最佳MOI值。
　　方法:
　　1.本實(shí)驗(yàn)使用全骨髓貼壁法分離提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD29、CD45和CD90的表達(dá)。使用骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)7d后進(jìn)行堿性磷酸酶成骨鑒定。
　　2.設(shè)置不同陽(yáng)離子脂質(zhì)體含量(0.2μl、0.3μl、0.4μl)及不同質(zhì)粒DNA含量(60ng、70ng、80ng)共9組，進(jìn)行非病毒

5、轉(zhuǎn)染MSCs，使用熒光顯微鏡觀察目的基因表達(dá)情況和細(xì)胞狀態(tài)篩選最佳陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA比。
　　3.構(gòu)建慢病毒載體，使用不同MOI值，設(shè)置MOI=0，10，20，50，100，200，400共7組，對(duì)MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用熒光顯微鏡觀察目的基因表達(dá)情況和細(xì)胞狀態(tài)篩選最佳MOI值。
　　結(jié)果:
　　1.使用全骨髓法成功提取MSCs，倒置顯微鏡下觀察MSCs貼壁生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)第三代MSCs穩(wěn)定均一表達(dá)CD29、CD9

6、0，幾乎不表達(dá)CD45。MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后7d，堿性磷酸酶檢測(cè)顯示促分化組ALP分泌明顯高于未分化組，繼續(xù)培養(yǎng)至10d后可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)形成。
　　2.使用不同組別陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MSCs72h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)陽(yáng)離子脂質(zhì)體含量0.3μl與質(zhì)粒DNA含量80ng組轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　3.使用不同MOI組別慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs，分別于3d、7d和10d熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)MOI=20時(shí)轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，細(xì)