甜葉菊品系“1096”離體培養(yǎng)及其UGT76G1酶基因的克隆.pdf

1、我國(guó)甜葉菊品種是80年代初開始引種的，由于該植物自交不育異花授粉，幾代雜合之后植株良莠不齊，需要篩選新的優(yōu)良品種，同時(shí)需要改進(jìn)種植方式。采用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能保持品種的優(yōu)良特性，還可不受外界條件的影響周年繁殖，在較短時(shí)間內(nèi)即可繁育出大批種苗；利用組織培養(yǎng)技術(shù)還將推動(dòng)甜葉菊的遺傳改良，彌補(bǔ)甜葉菊傳統(tǒng)育種的不足。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧食組織（WHO/FAO）所屬的食品添加劑專家委員會(huì)（JECFA）在第63次日內(nèi)瓦會(huì)議上認(rèn)可了甜葉菊提取物使用

2、的試行案。即人的體重每公斤每天可攝取0 ～2mg甜葉菊糖苷，同時(shí)規(guī)定糖苷的純度應(yīng)該大于95％，這就要求我們改進(jìn)生產(chǎn)工藝降低耗水量，增加純度，特別是生產(chǎn)口味純正的RebaudiosideA（RA）含量高的產(chǎn)品，或培育出高RA含量的甜葉菊新品種。
　　 本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，建立了本實(shí)驗(yàn)室采用改良DNS等方法篩選出的，高糖苷含量品系“1096”的組培快繁體系，為該品系在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；并探討了不同濃度蔗糖和甘露醇對(duì)其離

3、體保存的影響，為控制增殖繼代次數(shù)及甜葉菊優(yōu)良種質(zhì)的離體保存提供理論基礎(chǔ)；采用TD-PCR法克隆了控制由Steviolbioside 和Stevioside 到RebaudiosideA合成的UGT76G1酶的基因。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.采用甜葉菊品系“1096”為材料，研究了不同外植體、不同激素種類和配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化，生根及移栽的影響。結(jié)果表明：以莖尖為外植體愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)率均最高；其次是帶腋芽莖段；

4、再次為葉片。無(wú)腋芽莖段和無(wú)菌根均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但不能誘導(dǎo)成芽。莖尖不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L；葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+IAA1.0mg/L；帶腋芽莖段不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L。不定芽繼代增殖培養(yǎng)采用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L；在1/4MS+IBA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+1g/L活性炭的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，生根

5、率可達(dá)100％，生根苗移栽后成活率達(dá)95％。
　　 2.甜葉菊種質(zhì)離體培養(yǎng)保存具有一定的可行性。1/4MS+10g/L甘露醇更適合于甜葉菊品系“1096”的離體保存，試管苗經(jīng)過(guò)再生培養(yǎng)，均能恢復(fù)原有的形態(tài)，其葉型、株型等形態(tài)特征與對(duì)照沒(méi)有差別。
　　 3.利用反轉(zhuǎn)錄與TD-PCR技術(shù)克隆了甜葉菊品系“1096”UGT76G1酶的基因，并利用部分生物信息學(xué)軟件對(duì)克隆出的基因和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了分析，為今后利用生物工程手