膽固醇敏感器SCAP功能失調(diào)對(duì)細(xì)胞膽固醇代謝的影響機(jī)制.pdf

1、目的：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）裂解激活蛋白（SCAP）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個(gè)膜蛋白，能夠感受細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度的變化，影響下游膽固醇合成和攝入，通過Insig-SCAP-SREBPs-LDL受體/HMG-CoA還原酶通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。過去的研究中我們已經(jīng)證實(shí)炎癥因子炎癥因子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞大量攝取未氧化修飾的LDL，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，泡沫樣變。本研究在我們過去研究的基礎(chǔ)上，我們選用HMCs細(xì)胞系(

2、1)探討在炎癥狀態(tài)下，是否引起SCAP表達(dá)增加，從而引起LDL受體（LDLreceptor）及HMGcoA還原酶的表達(dá)增加，并且由于反饋失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇異常聚集和泡沫細(xì)胞形成；(2)在超表達(dá)SCAP狀態(tài)下，觀察是否引起細(xì)胞內(nèi)LDL受體和HMGCoA還原酶(HMGCoAreductase)表達(dá)增加，并且因反饋失調(diào)導(dǎo)致膽固醇細(xì)胞內(nèi)異常聚集而致泡沫細(xì)胞形成，同時(shí)超表達(dá)SCAP能否協(xié)同炎癥狀態(tài)下膽固醇的異常攝取和合成。(3)進(jìn)一步觀察SCA

3、P基因沉默狀態(tài)下是否引起細(xì)胞內(nèi)LDL受體和HMGCoA還原酶表達(dá)下調(diào)，同時(shí)拮抗炎癥狀態(tài)下的SCAP功能失調(diào)，從而減少炎癥狀態(tài)下膽固醇的異常攝取和合成。探索動(dòng)脈粥樣硬化疾病治療潛在的新靶點(diǎn)。
　　材料和方法：用分子克隆技術(shù)對(duì)超表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定、小量和大量制備SCAP超表達(dá)質(zhì)粒；用氯化銫密度梯度超速離心純化DNA；用電穿孔技術(shù)，轉(zhuǎn)染超表達(dá)SCAP的質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染帶有綠色熒光的對(duì)照質(zhì)粒，用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率；用電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染特異

4、的SCAPsiRNA，從而干擾SCAP的基因表達(dá)，同時(shí)設(shè)立RNA干擾的陰性和陽性對(duì)照。用酶學(xué)方法檢測HMCs細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)，游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)的水平；油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用real-time定量PCR技術(shù)分別檢測細(xì)胞的SCAP、LDL受體、HMGCoA還原酶水平；用Westernbloting檢測nSREBP2,LDL受體,HMGCoA還原酶和PCSK9蛋白表達(dá)水平。
　

5、　結(jié)果：
　　1.炎癥因子IL-1β或LPS能促進(jìn)腎系膜細(xì)胞SCAP的表達(dá)，從而增加下游LDL受體及HMGCoA還原酶mRNA、蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞膽固醇的外源性攝入和內(nèi)源性合成，導(dǎo)致膽固醇在細(xì)胞內(nèi)異常聚集。同時(shí)炎癥因子可以打破細(xì)胞膽固醇水平升高所致的反饋抑制調(diào)節(jié)，使胞內(nèi)膽固醇異常聚集。
　　2.在SCAP超表達(dá)狀態(tài)下，有類似炎癥因子作用引起細(xì)胞內(nèi)LDL受體和HMGCoA還原酶表達(dá)增加，從而增加細(xì)胞膽固醇的外源性攝入和內(nèi)源性合