sDR5-Fc抑制炎癥反應(yīng)改善大鼠心肌缺血-再灌注損傷.pdf

1、背景：急性心肌梗死(AMI)是對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害的心血管急危重癥。臨床治療AMI主要是梗死后在最短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行溶栓（尿激酶、鏈激酶等）和直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PCA)，以減小梗死范圍，挽救因氧氣和能量供應(yīng)不足而瀕臨死亡的心肌細(xì)胞。而在AMI的治療和自然轉(zhuǎn)歸過程中，常伴發(fā)心肌缺血-再灌注損傷（MI/RI），引起更大范圍的心肌細(xì)胞死亡，主要是再灌注加速了嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞的死亡過程，并伴隨了以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子產(chǎn)生為特征的強(qiáng)烈的炎癥

2、反應(yīng)，最終可能導(dǎo)致心肌梗塞、纖維化、心肌肥厚和心力衰竭。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子表達(dá)量的高低和缺血后心臟功能的損害與細(xì)胞壞死數(shù)量的多少密切相關(guān)，并在其中起了非常重要的作用。眾多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，通過藥物拮抗炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展可以有效下調(diào)炎癥反應(yīng)，從而改善缺血-再灌注損傷（I/RI）。在大鼠心肌缺血-再灌注（MI/R）模型中， Fucoidan可以通過抑制炎癥通路的活化，同時(shí)減少炎癥介質(zhì)表達(dá)及促炎細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕缺血-再灌注損傷來(lái)保護(hù)大鼠

3、肝臟；Dongdong Sun等的研究也證明，Luteolin可以抑制MPO及炎癥因子包括IL-6，IL-1α及TNF-α的表達(dá)，這些都有益于減少M(fèi)I/R后心肌梗死面積，提高心功能。
　　課題組經(jīng)過十余年的探索，發(fā)現(xiàn)TRAIL/ DR5與心肌梗死密切相關(guān)，前期利用酵母來(lái)源的人sDR5阻斷TRAIL/ DR5通路可顯著減少模型大鼠的AMI心肌梗死面積，減輕心肌梗死程度，相關(guān)成果已獲批國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)：ZL201210442685

4、.6）。此外， TRAIL可與其受體結(jié)合而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。為了延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期及增加療效，利于蛋白生產(chǎn)及純化，更好的向藥物開發(fā)轉(zhuǎn)化，我們進(jìn)一步將sDR5與人IgG1的Fc片段進(jìn)行融合，形成sDR5-Fc抗體融合蛋白，并構(gòu)建sDR5-Fc抗體融合蛋白高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO中進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)、純化，得到產(chǎn)量高、活性好的sDR5-Fc抗體融合蛋白。并推測(cè)，sDR5-Fc蛋白可通過阻斷 TRAIL，并抑制炎癥反應(yīng)，改善心肌缺血-再灌注

5、引起的炎性損傷，限制心肌梗死面積的擴(kuò)大從而保護(hù)心肌細(xì)胞。
　　我們?cè)谝延袌?bào)道和實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，通過建立心肌缺血-再灌注大鼠模型，檢測(cè)sDR5-Fc對(duì)心肌梗死面積的影響以及炎癥因子表達(dá)、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌纖維化情況，探討炎癥反應(yīng)在心肌缺血-再灌注大鼠模型中發(fā)揮的效應(yīng)及 sDR5-Fc對(duì)其的作用，綜合評(píng)價(jià)人sDR5-Fc蛋白作為新型心肌梗死治療藥物的可行性。為進(jìn)一步揭示心肌缺血-再灌注損傷機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為有效防治MI/R開辟

6、新思路。
　　目的：建立大鼠心肌缺血-再灌注模型，從大鼠心臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、蛋白水平、RNA水平及組織學(xué)等方面探討sDR5-Fc對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注（MI/R）的保護(hù)作用及相關(guān)炎癥機(jī)制。
　　方法：
　　1、建模及取材：我們選擇8周齡的Wistar雄性大鼠，將實(shí)驗(yàn)鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支使其心肌缺血，并在1h后松開結(jié)扎線行再灌注處理，建立大鼠急性心肌缺血-再灌注模型，并對(duì)各組大鼠給予相應(yīng)處

7、理：藥物組（sDR5-Fc，16mg/kg）、磷酸鹽緩沖液組（PBS和假手術(shù)（sham）組（只開胸不結(jié)扎，其他處理同PBS組）。同時(shí)在再灌注后3h、24h及2w時(shí)剝離心臟獲取結(jié)扎線下方的心臟組織。
　　2、模型及用藥效果鑒定：通過伊文氏藍(lán)-2,3,5-氯化三苯基四氮唑（Evans blue-TTC）雙色染色法檢測(cè)心肌梗死面積；利用蘇木素-伊紅染色（HE）檢測(cè)組織切片中心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；
　　3、模型中炎癥因子表達(dá)情況檢測(cè)：

8、通過實(shí)時(shí)定量 PCR（RT-PCR）及免疫印跡法（WB）測(cè)定心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)；用Quantity One軟件對(duì)WB結(jié)果進(jìn)行半定量分析。
　　4、模型中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況檢測(cè)：通過免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測(cè)心肌中巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況；
　　5、心功能檢測(cè)：通過超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心肌缺血1小時(shí)-再灌注2周（I1h-R2w）的大鼠心功能；
　　6、心肌纖維化檢測(cè)：通過

9、Masson三色染色法檢測(cè)心肌缺血1小時(shí)-再灌注2周的心肌纖維化情況。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立急性MI/R大鼠模型。
　　2、HE染色檢測(cè)大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化可見 PBS組梗死部位出現(xiàn)心肌細(xì)胞排列紊亂，有的細(xì)胞出現(xiàn)核破碎，心肌橫紋消失；與PBS組相比較，I/R+sDR5-Fc組梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞呈梭形排列，較為整齊有序，心肌橫紋明顯。
　　3、RT-PCR檢測(cè)心肌組織中炎癥因子mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，

10、PBS組的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)較Sham組上調(diào)；與PBS組相比，注射sDR5-Fc組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)下調(diào)。
　　4、Western blotting檢測(cè)心肌組織中炎癥因子表達(dá)，結(jié)果顯示，PBS組的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)較Sham組上調(diào)；與PBS組相比，注射sDR5-Fc組大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)下調(diào)；與RT-PCR結(jié)果一致。
　　5、免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，

11、PBS組巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)比Sham組增多；而sDR5-Fc注射處理組的浸潤(rùn)量減少。
　　6、心肌缺血-再灌注2周，與Sham組相比，PBS組超聲心動(dòng)圖顯示有明顯的心肌運(yùn)動(dòng)平緩，心電圖顯示有ST段抬高；而sDR5-Fc組ST段恢復(fù)平穩(wěn)，心功能較PBS組得到明顯改善。
　　7、心肌缺血-再灌注2周，心肌纖維化，與Sham組相比，PBS組與sDR5-Fc組有明顯的心肌纖維化；用藥sDR5-Fc后心肌纖維化面積比PBS組明顯