金黃色葡萄球菌α-溶血素的克隆、表達及全人源單鏈抗體的篩選.pdf

1、目的：抗體識別并與相應抗原特異性結(jié)合的能力，是機體抵御和清除外界入侵的重要手段。而抗體針對抗原特異性結(jié)合的能力和高度的親和力，使抗體在疾病的診斷和治療方面具有無可比擬的優(yōu)勢。抗體藥物從發(fā)展到現(xiàn)在，經(jīng)歷了多克隆抗體，單克隆抗體，基因工程抗體三個階段。多克隆抗體，作為多個B細胞內(nèi)產(chǎn)生的混合型抗體，對抗原的親和力高，但特異性不好。1975年雜交瘤細胞技術(shù)問世，人們可以制備出具有很好特異性的單克隆抗體。但這些單克隆抗體主要來自鼠源，此種異源性使

2、得機體會產(chǎn)生排斥反應。近年，更多研究的是基因工程抗體—又稱重組抗體，是利用重組DNA及蛋白質(zhì)工程技術(shù)對編碼抗體的基因按不同需要進行改造和重組而制備的抗體，目前基因工程抗體主要包括有嵌合抗體、人源化抗體、全人源抗體等。通過分子生物學基因工程技術(shù)可以獲得抗體，這些抗體是常規(guī)技術(shù)下不能得到的，更適合于臨床的診斷和治療。特別是利用體外篩選技術(shù)篩選全人源抗體，成為抗體藥物主要發(fā)展趨勢。金黃色葡萄球菌是人類感染的重要病原體，當前，金黃色葡萄球菌特別

3、是耐藥金黃色葡萄球菌 MRSA引起的感染，具有很高的死亡率，已經(jīng)成為了世界三大感染治療難題之一。而金黃色葡萄球菌的α溶血素（α-HL）是已被公認的最重要的致病毒素因子。本實驗通過表達純化可溶性金黃色葡萄球菌α-HL作為抗原，并在全人源抗體庫中經(jīng)過富集和篩選，制備抗α-HL全人源單鏈抗體，為金黃色葡萄球菌感染的診斷和治療提供新的方案。
　　方法：提取金黃色葡萄球菌總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術(shù)，得到α-HL cD

4、NA，再經(jīng)過巢式PCR連續(xù)兩次擴增得到α-HL DNA，將DNA與可溶性載體pCold-TF分別雙酶切后，通過T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli TOPO10，菌落 PCR后測序驗證插入基因的正確性。將測序驗證正確的α-HL/pCold-TF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21，15℃低溫誘導表達，SDS-PAGE和Western Blot驗證表達產(chǎn)物的正確性，并對表達產(chǎn)物SDS-PAGE進行進一步的可溶性驗證。用Ni-NTA親和純化系統(tǒng)經(jīng)

5、天然純化條件得到純化的α-HL蛋白。將純化的α-HL蛋白注射小鼠體內(nèi)，分離心臟血清得到α-HL多克隆抗體并進行效價測定。以生物素化α-HL蛋白為抗原利用噬菌體展示技術(shù)對前期構(gòu)建的天然抗體文庫進行3輪富集，用 ELISA檢測技術(shù)從富集的單鏈抗體文庫中篩選抗α-HL全人源單鏈抗體（scFv）。對檢測出的α-HL全人源單鏈抗體陽性克隆子進行大量表達，測序驗證其正確性，并用ELISA檢測技術(shù)，通過對多種細菌全菌的結(jié)合反應，檢測α-HL全人源單鏈

6、抗體對金黃色葡萄球菌的特異性。
　　結(jié)果：①.α-HL蛋白的表達純化及鑒定：從金黃色葡萄球菌成功提取出高質(zhì)量，高濃度的總 RNA，經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，再由PCR擴增得到的α-HL基因大小為900bp左右；經(jīng)與載體 pCold-TF連接，將重組質(zhì)粒α-HL/pCold-TF轉(zhuǎn)化E. coli BL21，經(jīng)15℃低溫誘導表達24h，得到可溶性的α-HL融合蛋白，融合蛋白大小為90 kDa左右（載體上的TF分子伴侶大小

7、為45 kDa左右）；經(jīng) SDS-PAGE和 western blot驗證表達純化的蛋白為α-HL融合蛋白。將純化的α-HL蛋白注射BABL/C小鼠制備抗血清，結(jié)果顯示抗血清與金黃色葡萄球菌結(jié)合良好，效價大于10,000倍。②.抗α-HL全人源單鏈抗體篩選與表達：以生物素化α-HL蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術(shù)對全人源抗體文庫進行3輪富集，用ELISA檢測方法反復篩選出α-HL全人源單鏈抗體陽性克隆子，將陽性克隆子大量表達后測序驗證了其