抵擋湯早期干預(yù)對(duì)2型糖尿病大鼠大血管內(nèi)皮細(xì)胞MLCK信號(hào)通路的調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　本課題通過(guò)觀察大鼠胸主動(dòng)脈的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A(PKA)的表達(dá)水平，及各組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞光鏡和電鏡下的變化，探討 MLCK信號(hào)通路在糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞中的調(diào)控作用，旨在揭示抵擋湯早期干預(yù)可以通過(guò)介導(dǎo) MLCK信號(hào)通路改變血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，為臨床預(yù)防糖尿病大血管并發(fā)癥提供新的思路及理論依據(jù)。通過(guò)觀察抵擋湯早、中、晚組實(shí)驗(yàn)療效的不同，進(jìn)一步詮釋中醫(yī)治未

2、病思想。
　　方法：
　　1.動(dòng)物造模
　　選取健康的SD雄性大鼠150只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，從中隨機(jī)抽取20只作為空白對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，剩余130只作為造模組，給予高脂飼料喂養(yǎng)。8周后，內(nèi)眥靜脈取血，檢測(cè)空腹血糖(FBG)和血清胰島素水平(Ins)。在造模組大鼠中隨機(jī)選取20只作為抵擋湯早期干預(yù)組，第8周開始給予抵擋湯灌胃，12周后開始造模。動(dòng)物出現(xiàn)胰島素抵抗后，除空白對(duì)照組予以相同劑量的枸櫞酸緩沖液外，其余

3、大鼠均予以鏈脲佐菌素（STZ）30mg/kg尾靜脈注射。3天后于大鼠尾靜脈處采血檢測(cè)隨機(jī)血糖，若血糖高于16.7mmol/L，則為造模成功。前期實(shí)驗(yàn)成模116只（成模率約89％），除抵擋湯早期干預(yù)組（造模前4周給藥），其余大鼠按體重、血糖分層隨機(jī)分成糖尿病組、抵擋湯中期給藥組（成模時(shí)給藥）、抵擋湯晚期給藥組（成模后4周給藥）、二甲雙胍組、辛伐他汀組。
　　2.檢測(cè)指標(biāo)
　　于24周將大鼠處死，取其胸主動(dòng)脈組織，存放于凍存管內(nèi)

4、，備用。用Western-Blot方法檢測(cè)MLCK的表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)cAMP、PKC、PKA的表達(dá)水平的變化，HE染色后觀察各組大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化，并在電鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞間連接的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　?。?）成模后，與空白對(duì)照組比較，造模組體重和血糖明顯升高，胰島素敏感指數(shù)降低。與糖尿病組比較，抵擋湯早、中干預(yù)組cAMP、PKA均升高，MLCK、PKC表達(dá)下降，有顯著差異（P<0

5、.05）；與抵擋湯晚期干預(yù)組比較，抵擋湯早期干預(yù)組 cAMP、PKA、MLCK、PKC改變更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；抵擋湯早期干預(yù)組與辛伐他汀組比較，無(wú)顯著差異（P>0.05）。
　?。?）觀察主動(dòng)脈組織HE染色變化：空白對(duì)照組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜相對(duì)完整、光滑，平滑肌細(xì)胞及彈力膜結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，平滑肌細(xì)胞未見明顯變性；糖尿病組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞排列不完整，大部分內(nèi)皮細(xì)胞缺失，部分平滑肌細(xì)胞變性、壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；

6、抵擋湯早期干預(yù)組和辛伐他汀組大鼠的動(dòng)脈內(nèi)膜相對(duì)光滑，內(nèi)皮細(xì)胞局部缺失，平滑肌細(xì)胞及彈力膜結(jié)構(gòu)排列規(guī)則；抵擋湯中、晚期干預(yù)組和二甲雙胍組動(dòng)脈內(nèi)膜不完整，部分內(nèi)皮細(xì)胞缺失，平滑肌細(xì)胞及彈力膜排列紊亂，伴少量平滑肌細(xì)胞變性、壞死。
　　（3）空白對(duì)照組的電鏡結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞完整，形成的緊密連接連續(xù)、致密，寬度在30-40nm之間，平滑肌細(xì)胞完整；糖尿病組內(nèi)皮細(xì)胞很薄不連續(xù)，細(xì)胞輪廓變的不清楚，彈力膜厚度不一且不均勻，平滑肌細(xì)胞線粒體腫脹

7、；抵擋湯早期干預(yù)組和辛伐他汀組細(xì)胞間連接較糖尿病組連續(xù)、致密，彈力膜增厚，平滑肌細(xì)胞正常；抵擋湯中、晚期干預(yù)組，二甲雙胍組內(nèi)皮細(xì)胞增厚，彈力膜厚度不一，平滑肌細(xì)胞完整。
　　結(jié)論：
　　抵擋湯早期干預(yù)可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性改變，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增強(qiáng)血管內(nèi)皮的防御功能，從而延緩糖尿病大血管病變的發(fā)生與發(fā)展。其機(jī)制可能為：抵擋湯早期干預(yù)可以提高cAMP、PKA的表達(dá)，降低PKC、MLCK的表達(dá)，從而調(diào)控MLCK信號(hào)通路，介