GALNT7參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究.pdf

1、【目的】鼻咽癌在中國南方發(fā)病率極高，尤其是廣東省，發(fā)病率較歐美等其他地區(qū)高25至30倍。鼻咽癌發(fā)生部位的隱匿性和早期臨床表現(xiàn)的不明顯性使得其早期診斷相對困難。而且，鼻咽癌具有高度侵襲性和轉移性，一旦發(fā)生轉移，患者愈后較差。目前作為鼻咽癌主要治療手段的放療亦面臨著腫瘤的輻射抗性和組織的嚴重損傷性兩大難以解決的問題。所以，探討鼻咽癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關機制至關重要。早日找到鼻咽癌特異性的標志物來指導臨床進行早期診斷、治療及預后評估，也必將帶

2、來重大的社會效益和經(jīng)濟效益。GALNT7是多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase, ppGalNAc-T)家族中的成員,是催化O-聚糖合成第一步的酶,O-糖基化與細胞識別、腫瘤細胞生長、轉移和粘附等功能密切相關。本實驗室前期工作利用QPCR的技術驗證了GALNT7在鼻咽癌組織和細胞中是低表達的，且其表達與miR-494的表達是負相關的。在此，我們旨在以鼻

3、咽癌為研究對象，采用RNAi沉默GALNT7的方法研究GALNT7在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的生理功能，為鼻咽癌早期診斷、治療，研制新的基因靶向藥物提供重要的實驗線索和依據(jù)。
　　【方法】我們用qRT-PCR檢測miR-494和GALNT7在30例鼻咽癌組織和20例鼻咽正常組織的表達量，雙熒光素酶報告載體實驗用來驗證GALNT7為miR-494的作用靶點，并且用qRT-PCR和western blot實驗分別在mRNA水平和蛋白水平驗證

4、了GALNT7為miR-494的作用靶點。MTT和克隆形成實驗用來檢測GALNT7對鼻咽癌細胞增殖的影響；Transwell和劃痕實驗用來驗證GALNT7對鼻咽癌細胞遷移和侵襲的影響；光天蛋白酶3-酶聯(lián)免疫吸附測定及Hoechst33258染色實驗檢測GALNT7對鼻咽癌細胞凋亡的的影響；最后用病毒穩(wěn)轉鼻咽癌細胞后注射到裸鼠皮下成瘤，觀察miR-494及GALNT7對動物水平瘤體生長的影響。
　　【結果】MiR-494表達量在鼻咽

5、癌組織較正常鼻咽組織下調，GALNT7的表達水平與miR-494的表達水平在鼻咽癌細胞中呈負相關。構建熒光素酶報告載體后與miR-494 mimic共轉染，與對照組相比，鼻咽癌細胞6-10B、9-4E和CNE2細胞中熒光素酶的活性被敲低(GALNT7，p=0.030，p<0.001，p=0.026)；共轉染miR-494 inhibitor，鼻咽癌細胞中GALNT7活性無明顯改變；構建的相應的突變體后再與miR-494 mimic、mi

6、R-494 inhibitor分別共轉染后發(fā)現(xiàn)其活性與對照組相比也未見明顯差異。QRT-PCR顯示miR-494過表達后GALNT7在mRNA水平下降。Western blot實驗證實miR-494 mimic明顯下調GALNT7的蛋白水平表達， miR-494 inhibitor對GALNT7蛋白水平表達的影響未見明顯差異。
　　MTT檢測顯示與對照組相比，GALNT7-siRNA對鼻咽癌細胞 CNE2、6-10B和9-4E在2

7、4h，48h和72h時的增殖抑制率分別為23.37％(24 h),17.76%(48 h),和24.86%(72 h)(p=0.015);14.28%(24 h),22.77%(48 h),和1.44%(72 h)(p=0.002);21.38%(24 h),20.58%(48 h),和41.84%(72 h)(p=0.003)?？寺⌒纬蓪嶒炛校珿ALNT7-siRNA使得和CNE2、6-10B和9-4E三株鼻咽癌細胞克隆云集塊少且小，

8、抑制率分別為75.4%,61.7%,46.9%（p<0.05）
　　Transwell遷移實驗顯示，GALNT7-siRNA對鼻咽癌細胞CNE2、6-10B和9-4E在48h后遷移抑制率分別為52.57%(p=0.008),46.95%(p=0.017),和62.5%(p=0.003)。劃痕實驗證實 GALNT7-siRNA對鼻咽癌細胞 CNE2、6-10B和9-4E在48h后遷移抑制率分別為41.45%(p=0.029),59.

9、34%(p=0.002),和66.66%(p=0.013)。Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，轉染了 GALNT7-siRNA的鼻咽癌細胞CNE2、6-10B和9-4E中細胞侵襲的數(shù)量分別減少37.85%(p=0.032),47.48%(p=0.049),和51.91%(p<0.001)。
　　光天蛋白酶3-酶聯(lián)免疫吸附測定實驗顯示轉染GALNT7-siRNA的鼻咽癌細胞與對照組細胞的光天蛋白酶3活性相比明顯升高（cne

10、2,9-4e,6-10b,p<0.05）。Hoechst33258染色實驗同樣也顯示相同結果，轉染GALNT7-siRNA的鼻咽癌細胞與對照組細胞相比在鏡下被染色的凋亡細胞明顯增多（p<0.05）。
　　裸鼠體內成瘤實驗顯示轉染GALNT7-siRNA的鼻咽癌細胞所成瘤體較轉染無意鏈鼻咽癌細胞所成的瘤體更小，重量較輕。GALNT7-siRNA組及miR-494 MIMIC組較各自對照組顯著抑制腫瘤的生長，GALNT7-siRNA組

11、最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為（809.56±179.53 mm3,749.77±143.1 mm3,518.88±85.52 mm3。siRNA對照組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為（1165.86±340.55 mm3,966.47±226.78 mm3,680.01±138.86 mm3），較對照組明顯減小(p=0.008, p=0.048, and p=0.035)。miR-494 MIMI

12、C組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為652.32±119.82 mm3,608.32±121.84mm3、530.54±104.28 mm3, MIMIC對照組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為887.27±270.4 mm3,861.91±186.33 mm3,666.59±95.44 mm3，較對照組明顯減小(p=0.048,p=0.004,p=0.018)，同樣這兩組的最終瘤體重量也較各自對照組為

13、輕（p<0.05）。然而轉染了miR-494 inhibitor的鼻咽癌細胞較其對照組的成瘤作用卻更加明顯，miR-494 inhibitor組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為1098.27±427.75 mm3,726.44±187.97 mm3,717.4±149.43 mm3, inhibitor對照組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為834.36±413.28 mm3,542.03±166.43

14、 mm3,549.4±98.03 mm3，miR-494 inhibitor組較其對照組所成腫瘤明顯更大(p=0.177, p=0.038, and p=0.019),同樣miR-494 inhibitor組的最終瘤體重量也較其對照組更重（p<0.05）。
　　【結論】GALNT7的表達量在鼻咽癌組織較鼻咽正常組織上調，MiR-494表達量在鼻咽癌組織較正常鼻咽組織下調，GALNT7的表達水平與miR-494的表達水平在鼻咽癌細胞