長鏈非編碼RNAUnigene56159在肝癌細(xì)胞中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞肝癌(hepatpcellular carcinoma, HCC)是發(fā)生于肝臟的，常見的發(fā)病率極高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移是主要特征。許多因子和表觀遺傳變化均與HCC形成密不可分，其中包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)。lncRNA是一類不具備編碼蛋白能力的長度超過200 nt的非編碼內(nèi)源性RNA分子，可以在多種層面調(diào)控基因表達(dá)，廣泛參與生物體各種生理及病理過程。至今，已有大量研究揭示了許多 lncRNAs

2、參與到人類疾病進(jìn)程中，尤其是癌癥。為了探究lncRNA在HBV相關(guān)的肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們利用深度測序技術(shù)篩選出一個(gè)在 HBV陽性的 HCC組織中異常高表達(dá)的新的 lncRNA分子Unigene56159。本研究擬解析Unigene56159在肝癌細(xì)胞中異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，并探尋其對肝癌細(xì)胞體外生長、遷移和侵襲等惡性行為的影響及作用機(jī)制，從而闡明Unigene56159在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制及可能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這將有助于我

3、們深入理解HBV感染誘導(dǎo)的lncRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：首先，通過RT-qPCR方法檢測HBV陰性和HBV陽性的HCC組織以及肝癌細(xì)胞系中 Unigene56159的表達(dá)情況。此外，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá) HBV各編碼蛋白的質(zhì)粒到HepG2和Huh7細(xì)胞中，通過RT-qPCR方法檢測Unigene56159的表達(dá)情況。進(jìn)一步利用細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)包括Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)分析Unigen

4、e56159對肝癌細(xì)胞HepG2和HepG2.2.15惡性行為的影響，并結(jié)合Western blot實(shí)驗(yàn)檢測Unigene56159對EMT的分子標(biāo)志物E-cadherin及Vimentin蛋白水平的影響，以評價(jià)Unigene56159對EMT進(jìn)程的影響。為了解析Unigene56159的具體作用機(jī)制，我們利用生物信息學(xué)方法預(yù)測靶定Unigene56159的候選miRNA，并運(yùn)用EGFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR方法證實(shí)了Unig

5、ene56159是miR-140-5p的直接靶基因并受其負(fù)性調(diào)控。隨后，我們進(jìn)一步探究了miR-140-5p對肝癌細(xì)胞HepG2.2.15和HepG2的生長以及遷移、侵襲行為的影響；此外，生物信息學(xué)軟件預(yù)測了miR-140-5p下游的靶基因Slug，用 EGFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR及 Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-140-5p可以直接靶定Slug使其表達(dá)下調(diào)；最后，用RT-qPCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢

6、測了Unigene56159對Slug的競爭性調(diào)控，EGFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)檢測了Unigene56159對Slug的調(diào)控是否是依賴miR-140-5p。
　　結(jié)果：RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Unigene56159在HBV陽性的HCC組織中表達(dá)上調(diào)。此外，Unigene56159在HBV陽性細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于HBV陰性細(xì)胞系HepG2；轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制型質(zhì)粒pHBV1.3后Huh7細(xì)胞中Unigene

7、56159的水平明顯高于對照組。這一數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了我們深度測序的結(jié)果。HepG2和Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBx的表達(dá)質(zhì)粒后，Unigene56159表達(dá)水平升高，表明HBV自身編碼的X蛋白誘導(dǎo)了Unigene56159的高表達(dá)。細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明 Unigene56159能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力及 EMT進(jìn)程，但對肝癌細(xì)胞活性及體外增殖能力影響不明顯，在肝癌細(xì)胞中扮演著癌基因的角色。利用生物信息學(xué)方法及 EGFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)和

8、RT-qPCR方法證實(shí)Unigene56159是miR-140-5p的直接靶基因并受其負(fù)性調(diào)控。而miR-140-5p能夠抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力及EMT進(jìn)程，同樣也不影響肝癌細(xì)胞的活性及體外增殖能力。進(jìn)一步生物信息學(xué)預(yù)測及 EGFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-140-5p直接靶定Slug并負(fù)性調(diào)控其表達(dá)。并且我們進(jìn)一步證實(shí)，在肝癌細(xì)胞中，Unigene56159能夠正向調(diào)控 Slug的 mRNA和蛋白水平。最終證實(shí)了Unigene