CD147分子調(diào)控Th17細(xì)胞應(yīng)答介導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增生和系統(tǒng)性炎癥為主要特征的常見自身免疫性疾病，但迄今為止，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來關(guān)于RA發(fā)病機(jī)制的研究表明，Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在RA病程的各個(gè)階段均發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞是一群以分泌IL-17為特征的T細(xì)胞亞群，其可由CD4+幼稚性 T細(xì)胞（Tn）和 CD4+記憶性 T細(xì)胞（Tm）誘導(dǎo)產(chǎn)生。盡管對 Th17細(xì)胞在RA發(fā)病中的重要作用已有深刻

2、認(rèn)識，但人體內(nèi)Th17細(xì)胞應(yīng)答的條件尚不完全清楚，且此前研究多集中于體外細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，而人體是一個(gè)相互交錯(cuò)的免疫網(wǎng)絡(luò)，多種免疫細(xì)胞如抗原體呈細(xì)胞（APC）可在Th17細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。其中有文獻(xiàn)報(bào)道，在RA患者關(guān)節(jié)病灶大量浸潤的APC輔助下，Th17細(xì)胞可由CD4+Tm誘導(dǎo)產(chǎn)生，且此誘導(dǎo)作用依賴于APC和T細(xì)胞的直接接觸，但具體機(jī)制不明。因此，探索RA炎癥狀態(tài)下參與調(diào)控APC誘導(dǎo)Th17細(xì)胞應(yīng)答的具體分子及機(jī)制具有重要意義。

3、
　　CD147分子是一種膜表面蛋白，表達(dá)于所有免疫細(xì)胞表面，在活化T細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，并在 T細(xì)胞發(fā)育、活化、增殖、遷移、粘附和侵襲等功能中均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。此外，有研究報(bào)道CD147參與APC和T細(xì)胞間形成的免疫突觸，進(jìn)而調(diào)控T細(xì)胞的活化。近期的研究顯示，CD147可通過抑制STAT3信號抑制小鼠的Th17細(xì)胞應(yīng)答，但是由于人類和小鼠在Th17細(xì)胞應(yīng)答上存在諸多差異，CD147在人體內(nèi)，尤其是RA炎癥狀態(tài)下，Th17細(xì)胞應(yīng)答中的

4、調(diào)控作用仍有待研究。
　　因此，為闡明CD147分子是否能通過調(diào)控Th17細(xì)胞應(yīng)答參與RA的發(fā)病，本課題研究了RA炎癥環(huán)境下，CD147分子在APC誘導(dǎo)Th17細(xì)胞應(yīng)答中的調(diào)控作用及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　收集RA患者和健康對照外周血或滑液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD161+T細(xì)胞及其分泌IL-17和/或IFN-γ的細(xì)胞水平；以及CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞（Mo）、C

5、D4+CD161+T細(xì)胞和CD4+CCR6+T細(xì)胞表面CD147的表達(dá)水平；并觀察CD4+ T細(xì)胞CD147表達(dá)與分泌IL-17和IFN-γ的關(guān)系。應(yīng)用Luminex技術(shù)檢測血漿中細(xì)胞因子IL-17、IL-1β、IL-6、IL-21和IFN-γ的水平。同時(shí)收集RA患者的基本信息、疾病活動(dòng)度和臨床檢測指標(biāo)。
　　采用免疫磁珠法分離純化健康對照和RA患者CD14+Mo與CD4+T細(xì)胞（包括CD4+Tn和CD4+Tm），進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo)T

6、h17細(xì)胞應(yīng)答，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD147單克隆抗體（mAb）等條件干預(yù)時(shí)CD4+T細(xì)胞分泌IL-17和/或IFN-γ的細(xì)胞水平；同時(shí)檢測胞內(nèi)pSTAT3、pAKT(T308)、pAKT(S473)、pS6和p70S6K的磷酸化信號水平。并應(yīng)用Luminex技術(shù)檢測培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-γ的水平。
　　應(yīng)用C57BL/6小鼠構(gòu)建膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）模型，CD147mAb治療后，進(jìn)行病理切片染色和關(guān)節(jié)炎評分，同時(shí)，收集

7、CIA小鼠外周血、脾臟和四肢引流淋巴結(jié)組織標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測分泌IL-17和/或IFN-γ的CD4+T細(xì)胞水平。
　　數(shù)據(jù)采用SPSS17.0和GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和分析。p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.RA患者外周血CD4+CD161+T細(xì)胞為分泌IL-17的主要細(xì)胞，CD161+Th17細(xì)胞比例顯著高于Th17細(xì)胞比例，且兩者顯著正相關(guān)。同時(shí)，RA患者CD

8、4+CD161+T細(xì)胞和CD161+Th17細(xì)胞比例顯著升高，并與疾病活動(dòng)度指標(biāo)顯著正相關(guān)。
　　2.在RA患者和健康對照，Th17細(xì)胞及其標(biāo)記細(xì)胞CD4+CD161+和CD4+CCR6+T細(xì)胞均高表達(dá)CD147分子，且Th17細(xì)胞比例可隨著CD147表達(dá)升高而增加。
　　3.明確在CD3mAb刺激條件下，CD4+Tm和脂多糖（LPS）活化的Mo以5:1比例共培養(yǎng)3天為誘導(dǎo)Th17細(xì)胞應(yīng)答的最佳條件。在此共培養(yǎng)條件下，CD1

9、47mAb可特異性抑制體外 LPS活化 Mo誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞產(chǎn)生和 IL-17分泌。同時(shí)， CD147mAb可明顯抑制CD4+Tm的pSTAT3、pAKT（T308）、pS6和p70S6K磷酸化水平。
　　4.RA患者關(guān)節(jié)滑液中活化Mo可誘導(dǎo)自體CD4+Tm產(chǎn)生Th17細(xì)胞應(yīng)答，且CD147mAb可特異性抑制病灶中活化Mo誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th17細(xì)胞應(yīng)答。
　　5.CD147mAb特異性降低CIA小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)中Th17細(xì)

10、胞水平的同時(shí)，可顯著改善CIA小鼠的關(guān)節(jié)紅腫癥狀和平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)，并減輕關(guān)節(jié)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤、滑膜組織增生和軟骨組織破壞。
　　結(jié)論：
　　本研究進(jìn)一步支持Th17細(xì)胞在RA發(fā)病中的重要作用，并提示CD4+CD161+T細(xì)胞和CD161+Th17細(xì)胞水平可作為判斷RA病情活動(dòng)度的細(xì)胞學(xué)指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)CD147分子表達(dá)水平與Th17細(xì)胞比例相關(guān)，且CD147可特異性調(diào)控RA炎性病灶中APC誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞應(yīng)答，其機(jī)制可能是通過CD1