百草枯殘留檢測ELISA試劑盒及百草枯模擬抗體的解毒效果研究.pdf

1、背景：百草枯是時下世界上應用最多的除草劑，對人和動物均有較強毒性。百草枯中毒在臨床中的死亡率極高，目前尚無明顯有效的救治方法。百草枯中毒的病死率與口服百草枯的量有密切關系，一般認為口服20％百草枯水劑>20 mg/kg即可導致死亡。目前我國多采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、紫外分光光度法、毛細血管電泳法、高效液相色譜法等進行檢測，但這些檢測方法均需要復雜的樣品前處理，在前處理過程中會丟失部分百草枯，造成檢驗結果的不準確，且不同樣品的百草枯殘留有各

2、自最佳的檢測方法，不僅加大了檢測難度還增加了檢測費用，因此需要建立一種高效、可靠、簡便的百草枯殘留檢測方法，指導臨床治療和判斷預后。 百草枯進入人體后通過炎癥反應、氧化損傷等導致各個器官均受損害，其中嚴重肺纖維化所致的呼吸衰竭是百草枯中毒最主要的死亡原因，因此減緩肺纖維化的進程，降低死亡率，是百草枯中毒治療的關鍵。目前臨床上首選的治療方法為血液凈化，但血液凈化費用昂貴，且研究發(fā)現(xiàn)血液凈化雖然能夠延長生存時間,但對降低病死率的作用不大。所

3、以百草枯中毒的治療方法一直是臨床上的難題，建立規(guī)范、標準、有效的治療方案是急需解決的問題。
　　目的：研制一種前處理簡單、靈敏度高，且能同時檢測食物、血液、尿液以及胃液中百草枯殘留的間接競爭ELISA試劑盒，以滿足農(nóng)業(yè)及臨床上的快速檢測需求；驗證百草枯模擬抗體對百草枯所致急性肺損傷的解毒效果，探討臨床應用的可行性。
　　方法：⑴利用抗原抗體特異性結合的原理，采用間接競爭 ELISA方法來檢測百草枯的殘留。首先合成百草枯完全抗

4、原（PQ-OVA）作為包被原，然后加入目標物與固定抗原共同競爭抗百草枯抗體，最后加入酶標二抗，顯色并終止后讀取OD450值，利用百草枯抗體與百草枯小分子的高度專一性來推算目標物中小分子的含量。⑵建立百草枯中毒大鼠模型，觀察抗百草枯模擬抗體對百草枯所致的急性肺損傷的解毒作用。首先純化抗百草枯模擬抗體，確保其能夠特異性識別百草枯小分子。然后建立百草枯中毒大鼠模型，選取6～8周的SPF級大鼠65只，體質(zhì)量200~250g，隨機分為3組，其中對

5、照組15只，染毒組25只，治療組25只，正常飼養(yǎng)條件。對照組腹腔注射無菌生理鹽水（NS）1.8 ml/kg；染毒組腹腔注射20%百草枯水劑18 mg/kg，20%百草枯水劑用無菌生理鹽水稀釋至10 mg/ml后再注射；治療組(PQ抗體組)在PQ中毒2h后立即尾靜脈注射抗PQ模擬抗體(1 mg/kg)，連續(xù)注射等劑量抗體3天。連續(xù)14天觀察各組大鼠的表現(xiàn)和反應，并分別于1、3、7、14天時處死3只大鼠，采血離心檢測TGF-β1和IL-6的

6、表達水平，并取左下肺葉于10%甲醛液浸泡后石蠟包埋,做成4μm厚的切片,蘇木精-伊紅染色(H-E染色)后行顯微鏡觀察病理變化，對比三組的不同點。
　　結果：①間接競爭ELISA最佳反應條件如下：包被抗原和一抗工作濃度分別為2.0μg/ml和1:28000；包被溫度和時間為4℃14h；封閉液為1% OVA；封閉量為150μl；封閉時間為45 min；競爭結合反應時間為45 min，二抗作用時間為30 min，酶標二抗?jié)舛葹?:400

7、0；顯色液比例為A/B=1/19；顯色時間10min。②試劑盒的最低檢測限即IC10為0.08 ng/ml，線性檢測范圍為0.16~10.76 ng/ml， IC50為1.32 ng/ml。該試劑盒與敵草快的交叉反應率僅為0.01348%.各種樣品添加回收率均高于80%，變異系數(shù)小于14%，板內(nèi)變異系數(shù)在0.24%~9.57%之間，板間變異系數(shù)在1.17%~11.09%之間，結果表明該ELISA法同國家標準檢測方法相比，其檢測靈敏度更高

8、。③百草枯模擬抗體成功表達，經(jīng)間接競爭ELISA驗證，其具有良好的競爭活性。以18 mg/kg的劑量成功建立了百草枯中毒模型，同時用百草枯模擬抗體解毒。中毒組顯微鏡觀察顯示,大鼠肺組織的損傷隨著實驗天數(shù)的增加而日益加重,成批的炎性細胞浸潤,肺纖維化逐日形成。而治療組肺組織炎癥減輕,實驗過程中未出現(xiàn)明顯纖維化。中毒組TGF-β1和IL-6水平隨著試驗時間的延長逐漸升高，而治療組在注射百草枯模擬抗體后TGF-β1和IL-6水平呈下降趨勢。<