中腦導水管周圍灰質P2X7受體在大鼠電針耐受中的作用.pdf

1、三磷酸腺苷（adenosine5'-triphosphate，ATP）是一種快速興奮性神經(jīng)遞質，與其受體結合后參與機體多種生理及病理機制的調節(jié)過程。目前，P2X受體已被克隆出P2X1~77種亞型。其中，P2X7受體由于其分子結構的特殊性近年倍受關注。P2X7受體在體內(nèi)組織廣泛表達，與炎癥、腫瘤以及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機制有著密切關系。在疼痛相關機制的研究中發(fā)現(xiàn)，P2X7受體參與炎癥性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛和癌性疼痛的調制機制。電針（elec

2、troacupuncture，EA）作為重要的非藥物鎮(zhèn)痛手段，廣泛應用于臨床并取得良好的鎮(zhèn)痛效果。但長時間的使用外周穴位電針刺激其鎮(zhèn)痛作用會逐漸減弱，最終引起電針耐受（electroacupuncture tolerance）。近年來研究發(fā)現(xiàn)，P2X受體激活參與電針鎮(zhèn)痛及耐受機制。中腦導水管周圍灰質( periaqueductal gray，PAG)為機體內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的重要組成部分，尤其是其外側區(qū)（lateral periaquedu

3、ctal gray， lPAG）是疼痛信息調制和電針耐受形成、維持的關鍵結構，但lPAG中P2X7受體激活是否參與電針耐受的形成和維持及其相關的信號機制尚不清楚。
　　目的：檢測多次外周穴位電針刺激后大鼠痛閾和lPAG中P2X7受體蛋白表達和功能變化，求證lPAG中P2X7受體活化后參與大鼠電針耐受的形成并對其相關的胞內(nèi)信號轉導機制進行初步探討。
　　方法：本實驗包括兩個部分：（一）在體實驗：健康雄性 Sprague Daw

4、ley（SD）大鼠在外周穴位多次給予電針刺激，建立電針耐受大鼠模型；每日檢測大鼠痛閾值，觀察其變化規(guī)律；6 d后取各組大鼠lPAG，免疫組化、免疫印跡和免疫熒光雙標法檢測P2X7受體在lPAG的表達部位及表達量變化情況；對電針耐受大鼠lPAG中微量注射不同劑量P2X7受體特異性拮抗劑A-740003，觀察其對大鼠痛閾和電針鎮(zhèn)痛作用的影響。（二）離體實驗：取<3 d的SD乳鼠lPAG組織，原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞，激光共聚焦檢測P2X7受體活化

5、對lPAG神經(jīng)元[Ca2+]i水平的影響。
　　結果：（一）在體實驗：假電針組大鼠在各觀察時間點機械痛閾變化值和熱痛閾變化
　　值以及l(fā)PAG中P2X7表達量與正常組大鼠比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；電針組大鼠痛閾變化值（包括機械痛閾變化值和熱痛閾變化值）與正常組比較顯著升高（P＜0.01），隨著電針刺激次數(shù)的增多其痛閾變化值逐漸下降，6次電針后趨近于正常組變化百分數(shù)值（P＞0.05），提示：大鼠電針耐受形成；免疫

6、組化、免疫印跡技術檢測提示電針耐受大鼠lPAG中P2X7受體陽性細胞數(shù)和P2X7受體蛋白表達上調，與同時間點正常組大鼠比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；通過對電針耐受大鼠lPAG微量注射10 nmol或100 nmol A-740003后，電針耐受大鼠機械痛閾及熱痛閾變化百分數(shù)值增高，A-740003可翻轉電針耐受效應；免疫熒光雙標法檢測提示：P2X7受體與神經(jīng)元特異性標記物NeuN在lPAG存在共表達，而與星形膠質細胞特異性標記

7、物GFAP及小膠質細胞特異性標記物 Iba1未見共表達。（二）離體實驗：激光共聚焦技術對[Ca2+]i水平檢測提示：P2X7受體激動劑BzATP可引起培養(yǎng)的lPAG神經(jīng)元細胞[Ca2+]i升高；給予P2X7受體特異性拮抗劑 A-740003或無鈣的細胞培養(yǎng)液分別預孵育10 min或20 min后，BzATP誘發(fā)的神經(jīng)元細胞[Ca2+]i升高被抑制。
　　結論：多次外周穴位電針刺激可引起正常大鼠痛閾變化百分數(shù)降低，形成電針耐受；電針