植物自交不親和性基因克隆及功能初步分析.pdf

1、目的:植物自交不親和性是植物生殖過程中普遍存在的一種現(xiàn)象,是植物特異性地識別并拒絕自身花粉或親緣關(guān)系很相近的花粉的一種遺傳機(jī)制。自交不親和識別過程是一個(gè)極其復(fù)雜的過程,在配子體型自交不親和反應(yīng)中涉及到花柱S-RNase與花粉SLF基因的識別過程,同時(shí)也有其他輔助因子參與。自交不親和現(xiàn)象在顯花植物中對植物優(yōu)良品種的保持和種子產(chǎn)量的提高均具有較大的影響。本研究中克隆得到自交不親和相關(guān)基因,目的是為作物育種提供一條重要的基因資源。
　　

2、方法:
　　(1)自交不親和性相關(guān)基因克隆:選取茄科矮牽牛園藝品種為實(shí)驗(yàn)材料。由于矮牽牛品種繁多,實(shí)驗(yàn)材料的基因型不確定,因此根據(jù)Genbank中已知的矮牽?；ㄖ鵖-RNase以及花粉SLF基因,進(jìn)行CLASTAL比對,設(shè)計(jì)兼并引物,利用PCR及RT-PCR技術(shù)克隆得到花柱sx及花粉SLF基因。
　　(2)番茄花粉特異性啟動子LAT52的克隆:提取番茄基因組DNA,根據(jù)已知的LAT52序列,設(shè)計(jì)特異性引物,克隆得到花粉特異性

3、啟動子LAT52。
　　(3)解淀粉芽孢桿菌中不育基因Barnase以及恢復(fù)基因Barstar的克隆:提取解淀粉芽孢桿菌的DNA,根據(jù)Genbank中已知的Barnase以及Barstar序列,設(shè)計(jì)特異性引物,PCR擴(kuò)增得到不育基因及其恢復(fù)基因。
　　最后用克隆出的花粉特異性啟動子LAT52,與相關(guān)基因sx、SLF、Barnase嵌合,構(gòu)建植物表達(dá)載體,將植物表達(dá)載體pBI121-LAT52-sx轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥、煙草,用

4、PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株,觀察對比野生型和轉(zhuǎn)基因植株的外部形態(tài),并做花粉TTC染色,對sx基因的育性做初步分析。同時(shí)將構(gòu)建的帶有除草劑標(biāo)記的不育基因植物表達(dá)載體pBI121-Ubi-epsps-LAT52-sx轉(zhuǎn)化經(jīng)濟(jì)作物薄荷,在得到轉(zhuǎn)基因植株后做花粉TTC染色以鑒定育性。
　　結(jié)論:
　　(1)本研究利用NCBI、CODEHOPE、PrimerPremier5.0等數(shù)據(jù)庫和生物軟件設(shè)計(jì)S-RNase基因的兼并引物,以矮牽?；ㄖ?/p>

5、cDNA為模板,RT-PCR手段擴(kuò)增到1條長為417bp的序列,在GenBank中比對發(fā)現(xiàn),該序列與SX基因相似性最高。然后以SX序列為模板設(shè)計(jì)特異性引物,RT-PCR擴(kuò)增到1條全長為747bp的目的片段,測序結(jié)果分析表明,該基因核苷酸序列開放閱讀框全長660bp,編碼220個(gè)氨基酸,其中包括有22個(gè)氨基酸的跨質(zhì)膜信號肽區(qū),和5個(gè)保守區(qū)(C1-C5)以及2個(gè)高變區(qū)(Hva、Hvb),該基因具有S-核酸酶功能。
　　(2)根據(jù)矮牽牛

6、花粉SLF同源基因保守區(qū)進(jìn)行CLASTALX比對,利用Primer5.0設(shè)計(jì)花粉特異性引物,以矮牽牛cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到一條1200bp左右的條帶,將該片段命名為SLF。測序結(jié)果用DNAMAN軟件比對發(fā)現(xiàn)該序列與Sn-SLF3基因氨基酸序列相似性較高,且與S7-SLF3氨基酸序列相似性最高,為86.63％,片段大小為1169bp。依照Kubo等對矮牽牛中的花粉SLF基因氨基酸的同源性比對和結(jié)構(gòu)區(qū)域分析,發(fā)現(xiàn)SLF同樣有一

7、F-box區(qū)。
　　(3)從番茄DNA中克隆到一長為717bp的花粉特異性啟動子LAT52。與GenBank登錄的LAT52序列相比,核苷酸相似性為99.44%。僅在非關(guān)鍵區(qū)多出7個(gè)堿基,有兩個(gè)堿基的突變;其中,多出的7個(gè)堿基AAAAAAT是一個(gè)簡單重復(fù)序列,在該變異位點(diǎn)有4個(gè)重復(fù),比GenBank登記的序列增加了一個(gè)。
　　(4)從解淀粉芽孢桿菌中克隆到348bp大小的不育基因(命名為BN)以及367bp大小的恢復(fù)基因(命

8、名為BR),并構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-LAT52-BN,預(yù)期轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,與pBI121-LAT52-sx植物表達(dá)載體作一比對。
　　為了使SX基因能在花粉中發(fā)揮其S-核酸酶功能,去掉22個(gè)氨基酸跨質(zhì)膜信號肽(命名為sx)之后,與番茄花粉特異性啟動子LAT52嵌合構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-LAT52-sx并轉(zhuǎn)化擬南芥。TTC花粉染色結(jié)果表明,LAT52能特異性的在花粉中調(diào)控sx基因的表達(dá),使花粉活力很低甚至沒有活力

9、,從而使轉(zhuǎn)基因植株不育,在對轉(zhuǎn)基因煙草花粉做TTC染色的同時(shí),統(tǒng)計(jì)花粉著色率,結(jié)果表明有92.3%的花粉著色較淺或沒有著色。進(jìn)而將帶有除草劑標(biāo)記的表達(dá)載體與花粉特異性啟動子啟動的sx基因嵌合,構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-Ubi-epsps-LAT52-sx,并將其轉(zhuǎn)化經(jīng)濟(jì)作物薄荷,得到轉(zhuǎn)基因抗除草劑薄荷植株,花粉染色試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)基因薄荷花粉活力很低甚至沒有活力,證明該基因具有使植株不育的功能。將抗除草劑基因與不育基因融為一體,將為薄荷