沉默BMI-1、RNF2基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞放射敏感性的影響.pdf

1、第一部分：BMI-1、RNF2基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系
　　目的：食管鱗狀細(xì)胞癌（esohaphageal squamous cell carcinoma，ESCC）是嚴(yán)重威脅人類生命及健康的癌癥之一。放療是中晚期食管鱗癌患者重要的治療方法，然而，由于放射抵抗性的存在，部分患者的預(yù)后仍很差。B細(xì)胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點(diǎn)-1（B-cell-specific Moloney murine le

2、ukemia virus integration site-1，BMI-1）和環(huán)指蛋白2（RING finger protein，RNF2）均屬于多梳基因家族（polycomb group，PcG）成員，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，本文旨在通過檢測(cè) BMI-1和 RNF2在 ESCC組織及相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)變化，分析其與患者臨床病理特征及術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系。
　　方法：
　　1.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)人食管鱗癌組織及

3、相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中BMI-1和RNF2的表達(dá)。
　　2.通過Western blotting方法檢測(cè)人食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中BMI-1和RNF2蛋白的表達(dá)水平。
　　3.分析BMI-1和RNF2表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)BMI-1和RNF2表達(dá)變化
　　免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，BMI-1和RNF2蛋白主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核。60例食

4、管鱗癌組織中，BMI-1陽性表達(dá)32例，表達(dá)率為53.33％；60例相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中，BMI-1蛋白陽性表達(dá)5例，表達(dá)率為8.33%。64例食管鱗癌組織中，RNF2蛋白陽性表達(dá)35例，表達(dá)率為54.69%；64例相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中，RNF2蛋白陽性表達(dá)7例，表達(dá)率為10.94%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，癌組織中BMI-1、RNF2蛋白的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁正常粘膜組織（P<0.001）。
　　2.Western blott

5、ing檢測(cè)BMI-1和RNF2的蛋白表達(dá)變化
　　Western blotting檢測(cè)124例食管鱗癌患者癌組織內(nèi)BMI-1、RNF2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示與癌旁正常粘膜組織相比，食管鱗癌組織內(nèi)BMI-1、RNF2蛋白表達(dá)量均明顯高于癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)量，分別為0.317±0.098 vs1.032±0.210、0.206±0.028 vs1.070±0.153，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與免疫組化的檢測(cè)結(jié)果一致

6、。
　　3.BMI-1、RNF2與食管鱗癌患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系
　　食管鱗癌組織中 BMI-1、RNF2蛋白的表達(dá)高低與腫瘤大?。≒＝0.022，P＝0.024）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.011，P＝0.015）及TNM分期（P＝0.021，P＝0.027）密切相關(guān)，與患者年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)等參數(shù)的差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）； Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示， BMI-1、RNF2陽性表達(dá)者的總

7、生存率明顯低于陰性表達(dá)者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；BMI-1陽性表達(dá)者和陰性表達(dá)者的3年生存率分別為18.80%和58.30%，中位生存時(shí)間分別為14個(gè)月和26個(gè)月。RNF2陽性表達(dá)者和陰性表達(dá)者的3年生存率分別為14.30%和48.30%，中位生存時(shí)間分別為15個(gè)月和24個(gè)月。
　　結(jié)論：
　　1.在人食管鱗癌組織中BMI-1和RNF2蛋白高表達(dá)。
　　2.BMI-1和RNF2在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平

8、與腫瘤惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后有關(guān)，為食管鱗癌患者分子靶向治療提供新思路。
　　第二部分：沉默BMI-1、RNF2基因?qū)w外食管鱗癌細(xì)胞放射敏感性的影響
　　目的：通過靶向沉默BMI-1和RNF2基因，研究BMI-1和RNF2蛋白表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞 X線照射后的增殖水平、遷移能力、細(xì)胞周期分布及凋亡等生物學(xué)特性的影響及與 DNA損傷修復(fù)基因的關(guān)系，探討B(tài)MI-1和RNF2對(duì)食管鱗癌細(xì)胞放射敏感性的調(diào)控。
　　

9、方法：
　　1.采用Western blotting方法檢測(cè)人食管鱗癌細(xì)胞系TE13、KYSE30、ECA109和KYSE170中BMI-1和RNF2蛋白的表達(dá)水平。
　　2.構(gòu)建敲低BMI-1和 RNF2的真核表達(dá)載體（pGLV3-H1-BMI-1和pGLV3-H1-RNF2），分別轉(zhuǎn)染食管鱗癌 ECA109和 TE13細(xì)胞株，用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定BMI-1和RNF2低表達(dá)的ECA109-shB

10、MI-1（ECA109-shRNF2）和 TE13-shBMI-1（TE13-shRNF2）細(xì)胞及各自陰性對(duì)照的ECA109-NC和TE13-NC細(xì)胞。分別采用qRT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)BMI-1和RNF2基因的沉默效率。
　　3.分別采用MTS法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默BMI-1和RNF2基因表達(dá)后對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖水平和放射敏感性的影響。
　　4.采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默BMI-

11、1和RNF2基因表達(dá)后對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響。
　　5.應(yīng)用 Western blotting法檢測(cè) BMI-1、RNF2及其下游γH2AX和H2AK119ub在不同食管鱗癌細(xì)胞系中隨照射時(shí)間和照射劑量的變化情況；采用激光共聚焦檢測(cè)上述蛋白在細(xì)胞核內(nèi)斑點(diǎn)隨照射時(shí)間和照射劑量變化的分布。采用免疫共沉淀方法檢測(cè) BMI-1、RNF2與γH2AX、H2AK119ub之間的關(guān)系。
　　6.采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)沉默BMI-1和R

12、NF2基因表達(dá)后對(duì)各組食管鱗癌細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的影響。
　　7.采用Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CDK4、Cycle D2、P16）和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（bcl-2、bax）的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.BMI-1和RNF2在不同食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)
　　Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，BMI-1和RNF2蛋白在4種食管鱗癌細(xì)胞系TE13、KYSE30、ECA10

13、9和 KYSE170中均有不同程度的表達(dá)。其中，BMI-1和RNF2蛋白在ECA109和TE13細(xì)胞系中的表達(dá)量相對(duì)較高（P<0.01）。
　　2.BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞沉默效果
　　為了檢測(cè)BMI-1和RNF2對(duì)食管鱗癌放射敏感性的影響，選擇BMI-1和 RNF2表達(dá)量相對(duì)較高的ECA109和 TE13細(xì)胞株進(jìn)行基因沉默。qRT-PCR和 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，

14、與 ECA109-control、ECA109-NC細(xì)胞相比，ECA109-shBMI-1細(xì)胞中BMI-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。同樣，TE13-shBMI-1細(xì)胞中BMI-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯低于TE13-control、TE13-NC細(xì)胞（P<0.01）。RNF2 mRNA和蛋白在ECA109和TE13細(xì)胞中的表達(dá)情況與BMI-1結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMI-1 shRNA和RNF2

15、 shRNA均有效抑制了BMI-1和RNF2基因在ECA109和TE13細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.沉默BMI-1和RNF2對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖水平和克隆形成的影響
　　MTS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，未行X線照射時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h后，轉(zhuǎn)染BMI-1 shRNA或轉(zhuǎn)染RNF2 shRNA的ECA109和TE13細(xì)胞的吸光度值均顯著低于各自control、NC組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），照射后48h、72h這種趨勢(shì)更明

16、顯（P<0.01）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示，BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組細(xì)胞的D0、Dq、SF2值均明顯低于control與NC組，外推數(shù)N值顯著高于control與NC組（P<0.05）。control與NC組細(xì)胞放射敏感性的差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而 BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組細(xì)胞的放射敏感性明顯高于control與NC組（P<0.05）。
　　4.沉默BMI-1和RNF2對(duì)食管鱗癌

17、細(xì)胞遷移能力的影響
　　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，穿過基底膜的ECA109-BMI-1 shRNA和ECA109-RNF2 shRNA組細(xì)胞數(shù)明顯低于穿過基底膜的control與 NC組細(xì)胞數(shù)（P<0.05）。此外，穿過基底膜的TE13-BMI-1 shRNA和TE13-RNF2 shRNA組細(xì)胞數(shù)也明顯低于穿過基底膜的control與NC組細(xì)胞數(shù)（P<0.05）。
　　5.BMI-1、RNF

18、2與DNA損傷修復(fù)基因的關(guān)系
　　Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，BMI-1、RNF2與H2AK119ub、γH2AX蛋白隨著照射劑量的增加而增加，在6Gy照射后1~2h三種蛋白表達(dá)量最高，隨后逐漸下降，24h接近照射前水平，三種蛋白的變化趨勢(shì)一致，存在時(shí)間依賴性和劑量依賴性。激光共聚焦結(jié)果顯示，γH2AX與BMI-1、RNF2在細(xì)胞核內(nèi)的斑點(diǎn)數(shù)量隨著照射劑量的增加而增加；此外，在6Gy照射后1~2h核內(nèi)斑點(diǎn)達(dá)到峰值

19、，隨后逐漸減少，24h接近照射前水平，三者隨照射劑量和照射后時(shí)間變化的規(guī)律基本一致。免疫共沉淀結(jié)果顯示，照射前BMI-1、RNF2蛋白的表達(dá)與H2AK119ub、γH2AX蛋白表達(dá)未見明顯相關(guān)性，而照射后H2AK119ub、γH2AX表達(dá)均與BMI-1、RNF2蛋白表達(dá)密切相關(guān)。
　　6.沉默BMI-1和RNF2對(duì)照射前、后食管鱗癌細(xì)胞周期分布的影響
　　未照射時(shí)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期中各期比例的差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0

20、5）。而照射后各組 G0/G1期細(xì)胞比例均較照射前明顯減低（P<0.05），且BMI-1 shRNA、RNF2 shRNA組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于control與NC組（P<0.01）；照射后各組G2/M期細(xì)胞比例均明顯高于相應(yīng)未照射組（P<0.05），且照射后BMI-1 shRNA、RNF2 shRNA組G2/M期細(xì)胞比例明顯低于control與NC組（P<0.01）。照射前、后各組處于S期細(xì)胞比例的差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0

21、.05）。
　　7.沉默BMI-1和RNF2基因?qū)φ丈淝?、后食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響
　　結(jié)果顯示，照射后各組細(xì)胞凋亡率均明顯高于相應(yīng)未照射組（P<0.05）。照射前BMI-1 shRNA組細(xì)胞凋亡率較control與NC組高，但差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），照射后BMI-1 shRNA組細(xì)胞凋亡率明顯高于control與NC組（P<0.01）；照射前，RNF2 shRNA組細(xì)胞凋亡率顯著高于control和NC組，差異

22、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），照射后這種趨勢(shì)更明顯（P<0.01）。
　　8.沉默BMI-1和RNF2基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　1)沉默BMI-1和RNF2基因?qū)φ丈淝?、后食管鱗癌細(xì)胞表達(dá)Cyclin D2、CDK4、P16的影響
　　Western blotting結(jié)果顯示，照射后各組細(xì)胞中Cyclin D2、CDK4、P16蛋白表達(dá)明顯高于相應(yīng)未照射組（P<0.05）。與contro

23、l和NC組相比，照射前BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組細(xì)胞中Cyclin D2、CDK4蛋白的表達(dá)水平顯著降低，而P16蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），照射后這種趨勢(shì)更明顯（P<0.01）。
　　2)沉默BMI-1和RNF2基因?qū)φ丈淝?、后食管鱗癌細(xì)胞表達(dá)bcl-2、bax的影響
　　研究結(jié)果顯示，照射后各組細(xì)胞中bcl-2、bax蛋白表達(dá)明顯高于相應(yīng)未照射組（P<0.05）；與control與NC組相

24、比，照射前BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下降，而bax蛋白的表達(dá)水平明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），照射后這種趨勢(shì)更明顯更明顯（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.沉默 BMI-1和 RNF2基因表達(dá)可將食管鱗癌細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而有效抑制了食管鱗癌細(xì)胞的增殖水平和遷移能力，促進(jìn)了食管鱗癌細(xì)胞的放射敏感性。
　　2.BMI-1

25、和 RNF2對(duì)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的調(diào)控通過與H2AK119ub、γH2AX相互作用以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
　　第三部分：沉默BMI-1、RNF2基因?qū)θ耸彻荀[癌細(xì)胞裸鼠移植瘤體內(nèi)放射增敏效應(yīng)的觀察
　　目的：建立裸鼠移植瘤模型觀察BMI-1和RNF2基因沉默后食管鱗癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤效應(yīng)，并分析其分子改變，以探討 BMI-1和RNF2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　方法：

26、>　　1.分別以 TE13-control、TE13-pGLV3-H1、TE13-BMI-1 shRNA和TE13-RNF2 shRNA細(xì)胞接種BALB/c/nu裸鼠，建立裸鼠移植瘤模型，觀察裸鼠成瘤及皮下腫瘤生長情況。
　　2.在裸鼠移植瘤長至直徑約為0.8~1.0cm時(shí)照射裸鼠，照射后24 h處死，Western blotting法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)BMI-1和RNF2蛋白的表達(dá)。
　　3.TUNEL方法檢測(cè)各組荷瘤裸鼠腫瘤

27、組織的凋亡情況。
　　4.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組荷瘤裸鼠腫瘤組織中BMI-1、RNF2及凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.沉默BMI-1和RNF2基因?qū)δ[瘤成瘤和移植瘤生長抑制的影響
　　觀察后發(fā)現(xiàn)，NC組對(duì)裸鼠移植瘤的生長未見顯著影響，而沉默BMI-1或RNF2基因后，裸鼠移植瘤生長緩慢，腫瘤體積較小，與control、NC組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），照射后這種趨勢(shì)更

28、明顯。control與NC組裸鼠移植瘤生長速度最快，沉默BMI-1或RNF2后移植瘤生長速度減慢，照射后移植瘤生長速度更慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NC組、NC+照射組、BMI-1 shRNA組、BMI-1 shRNA+照射組、RNF2 shRNA組、RNF2 shRNA+照射組移植瘤的生長抑制率分別為：8.22%、52.52%、29.71%、76.26%、33.42%、75.73%，沉默BMI-1或RNF2聯(lián)合照射組裸鼠腫

29、瘤的體積、重量均明顯減低，表明采用RNA干擾技術(shù)降低腫瘤細(xì)胞中BMI-1和RNF2蛋白的表達(dá)，在體內(nèi)確實(shí)發(fā)揮了放射增敏作用。
　　2.體內(nèi)BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞的沉默效果Western blotting結(jié)果顯示，沉默BMI-1或RNF2基因組裸鼠移植瘤中BMI-1和RNF2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.01），體內(nèi)實(shí)驗(yàn)沉默BMI-1、RNF2蛋白表達(dá)的效果明顯，沉默效率分別為66.67%和68

30、.21%。
　　3.沉默BMI-1或RNF2對(duì)裸鼠移植瘤組織凋亡的影響
　　TUNEL法檢測(cè)剝離腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，照射后各組移植瘤的凋亡水平均明顯高于其照射前凋亡水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，照射前BMI-1 shRNA或RNF2 shRNA組移植瘤的凋亡水平均顯著高于control與NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），照射后這種趨勢(shì)更明顯。表明BMI-1或RNF2敲低聯(lián)合放射線照射能誘導(dǎo)移植瘤組織的凋

31、亡，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性。
　　4.腫瘤組織標(biāo)本中BMI-1和RNF2蛋白的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMI-1和RNF2蛋白主要在細(xì)胞核表達(dá)，而較少在細(xì)胞漿表達(dá)。與照射前相比，照射后各組腫瘤組織中 BMI-1和RNF2蛋白的表達(dá)水平稍高，但差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；此外，照射前BMI-1 shRNA或RNF2 shRNA組細(xì)胞中BMI-1和RNF2蛋白的表達(dá)水平均明顯低于control與N

32、C組（P<0.05），照射后這種趨勢(shì)更明顯。
　　5.腫瘤組織標(biāo)本中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，照射后各組bcl-2蛋白的表達(dá)水平均顯著低于相應(yīng)的未照射組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與control、NC組相比，照射前BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組bcl-2蛋白的表達(dá)水平均明顯下降（P<0.05）；與control或NC聯(lián)合照射組相比，BMI-1 shRNA或RNF2 shRN

33、A聯(lián)合照射組bcl-2蛋白的表達(dá)水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　照射后各組bax蛋白的表達(dá)水平均顯著高于相應(yīng)的未照射組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與control、NC組相比，照射前BMI-1 shRNA和RNF2 shRNA組bax蛋白的表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05）；與control或NC聯(lián)合照射組相比，BMI-1 shRNA或RNF2 shRNA聯(lián)合照射組bax蛋白的表達(dá)水平均顯著增加