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文檔簡(jiǎn)介
1、漆酶(laccase,EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶,其作用底物非常廣泛,包括酚類、芳胺類、羧酸類、甾體激素和生物色素等。漆酶不僅在木質(zhì)素的降解和制漿造紙中有重要的應(yīng)用前景,而且在廢水處理、生物漂白、環(huán)境污染物降解、土壤修復(fù)、生物監(jiān)測(cè)、食品加工和有機(jī)合成等方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
目前,自然環(huán)境中絕大部分的微生物不易獲得分離和培養(yǎng),這極大限制了人們對(duì)微生物資源的有效利用。宏基因組學(xué)方法避開了傳統(tǒng)的微生物分離
2、培養(yǎng)方法,直接從環(huán)境樣品中提取總基因組DNA,通過構(gòu)建和篩選宏基因組文庫(kù)來獲得新的功能基因或生物活性物質(zhì)。宏基因組文庫(kù)包括了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物遺傳信息,因此增加了獲得新的功能基因和生物活性物質(zhì)的機(jī)會(huì)。
在論文中,我們從紅樹林環(huán)境樣品中提取總基因組,構(gòu)建了一個(gè)的宏基因組文庫(kù),并從中篩選獲得一個(gè)新的漆酶基因。采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該基因進(jìn)行高效表達(dá),并研究其重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)和在降解環(huán)境污染物方面的應(yīng)用,此外,為了進(jìn)一步
3、提高該漆酶的酶活性及對(duì)環(huán)境污染物的降解能力,利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行分子改造。主要研究結(jié)果如下:
構(gòu)建了近海紅樹林環(huán)境樣品的宏基因組文庫(kù),通過功能篩選方法,成功篩選出一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物具有漆酶活性的新基因,命名為lac591。該基因序列全長(zhǎng)1500bp,編碼500個(gè)氨基酸殘基,推測(cè)其分子量為57.4 kDa。通過蛋白序列分析發(fā)現(xiàn),漆酶Lac591含有4個(gè)作為銅離子結(jié)合位點(diǎn)的組氨酸保守區(qū)域。同源性比對(duì)結(jié)果表明,該基因與細(xì)菌
4、漆酶有中等程度的同源性,最高的是與嗜堿芽孢桿菌(Bacillushalodurans C-125)的漆酶為52%。該基因已經(jīng)提交到GenBank,登錄號(hào)為GQ468313。
將篩選出的漆酶基因lac591連接到pET-32a(+)表達(dá)載體上,并轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Escherichia coli BL21(DE3)中,使用終濃度為1.0 mM IPTG及0.25 mM CuSO4,在30℃誘導(dǎo)8 h,目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最高,為38
5、0 mg/L,是已知漆酶基因中的最高表達(dá)量。重組漆酶蛋白對(duì)多種常見底物的比酶活分別為12.73 U/mg(2,6-DMP)、5.43 U/mg(α-萘酚)、7.35 U/mg(鄰苯二酚)、1.02 U/mg(愈創(chuàng)木酚)、0.51U/mg(丁香醛連氮),以及0.15 U/mg(ABTS)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,純化后的重組蛋白的分子量約為75 kDa(其中18 kDa為表達(dá)載體上的融合蛋白標(biāo)簽分子量),結(jié)合Native-PAGE分
6、析結(jié)果,推斷該漆酶為單亞基蛋白。酶學(xué)性質(zhì)研究顯示,純化后漆酶對(duì)多種研究底物的最適反應(yīng)pH值分別為8.0(2,6-DMP),8.2(α-萘酚),9.0(鄰苯二酚),7.5(愈創(chuàng)木酚),8.0(丁香醛連氮)以及7.4(ABTS);在pH7.0~10.0范圍內(nèi)仍能保留大于80%的酶活(以愈創(chuàng)木酚為底物),表明該酶為堿性漆酶;此外,該酶的最適反應(yīng)溫度為55℃,且在50℃以下溫度處理30 min能保留70%以上的酶活性(以愈創(chuàng)木酚為底物)。不同的
7、金屬離子對(duì)漆酶活性有不同程度的影響,在1 mM低濃度條件下,Ca2+和Fe2+使酶活性分別提高到150%和140%,Mn2+、Mg2+、Co2+、Na+和K+對(duì)酶活性影響不明顯,Ni+、Zn2+和Al3+則使酶活性降低至77%、55%和68%;而在100 mM高濃度下,Ca2+使酶活性提高2倍,Mg2+、Na+和K+使酶活性分別提高到125%、120%和110%,Mn2+使酶活性降低至70%,Co2+、Zn2+、Fe2+、Ni+和Al3
8、+則使漆酶完全失活。1 mM EDTA能完全抑制重組漆酶Lac591的酶活性;1 mM的尿素和咪唑?qū)γ富钚缘挠绊懖幻黠@,但100 mM的尿素和咪唑則分別抑制酶活性至20%和46%;1 mM的SDS抑制酶活性至42%,100 mM的SDS則使漆酶完全失活。此外,該酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)kcat/Km顯示,2,6-DMP為該酶的最適反應(yīng)底物,其余底物依次為鄰苯二酚、α-萘酚、愈創(chuàng)木酚、丁香醛連氮和ABTS。
在研究重組漆酶Lac591
9、對(duì)環(huán)境污染物的降解時(shí)發(fā)現(xiàn),在金屬離子Ca2+和小分子介體ABTS(或HBT)存在的情況下,重組漆酶Lac591處理染料14 h后,其降解率分別為11%(堿性藍(lán)3)、25%(亞甲基藍(lán))、57%(溴酚藍(lán))、60%(結(jié)晶紫)、37%(亮藍(lán)R)和10%(酸性紫7);而對(duì)靛紅染料,漆酶處理60 min其降解率即可達(dá)到100%。此外,在小分子介體ABTS(或HBT)存在的情況下,Lac591處理堿木質(zhì)素14 h后,其降解率可達(dá)11%。結(jié)果表明,該漆
10、酶在降解環(huán)境污染物中具有一定的應(yīng)用前景。
由于我們所篩選出的漆酶Lac591存在比酶活性較低,因此我們進(jìn)一步采用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行分子改造。通過三輪易錯(cuò)PCR方法構(gòu)建了隨機(jī)突變文庫(kù),以愈創(chuàng)木酚底物酶活力為篩選指標(biāo),最終獲得酶活性提高的突變酶(Lac3T93)。經(jīng)氨基酸序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)突變酶共有4個(gè)氨基酸發(fā)生了替換,突變點(diǎn)分別是E316V、F62L、V55A和N40S。與野生型漆酶相比較,突變酶的酶活性分別提高了4.1倍
11、(4.10 U/mg,以愈創(chuàng)木酚為底物),和4.8倍(61.22 U/mg,以2,6-DMP為底物)。突變酶的最適反應(yīng)溫度提高了5℃,達(dá)到60℃,其最適反應(yīng)pH值從7.5提高到8.0(以愈創(chuàng)木酚為底物),但突變酶的溫度和pH穩(wěn)定性未見明顯改善。此外,在相同條件下,突變酶Lac3T93對(duì)堿性藍(lán)3、亞甲基藍(lán)、溴酚藍(lán)和結(jié)晶紫等染料的降解率分別提高至26%、55%、79%和83%;并且對(duì)靛紅染料完全降解所需時(shí)間由60 min縮短到40 min;
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