人源蛋白質(zhì)ARAP3選擇性識別RhoA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)以及擬南芥蛋白質(zhì)APUM23特異性識別18S核糖體RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).pdf

1、本論文的第一章介紹了我們關(guān)于含有兩個GTP酶激活蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的人源蛋白質(zhì)ARAP3選擇性識別RhoA的結(jié)構(gòu)與功能研究。ARAP3是一個多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，它含有1個ArfGAP結(jié)構(gòu)域、1個RhoGAP結(jié)構(gòu)域、1個SAM結(jié)構(gòu)域、5個PH結(jié)構(gòu)域、以及1個RA結(jié)構(gòu)域。ARAP3的特點是同時擁有兩個具有活性的GTP酶激活蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中ArfGAP可以選擇性地識別并加速Arf6-GTP水解為Arf6-GDP，RhoGAP可以選擇性地識別并加速R

2、hoA-GTP水解為RhoA-GDP。PtdIns(3，4，5)P3與ARAP3的結(jié)合可以提高ArfGAP的活性，Rap1-GTP與ARAP3的結(jié)合可以提高RhoGAP的活性。ARAP3很多生物學(xué)功能都與它的RhoGAP結(jié)構(gòu)域的活性有關(guān)，如參與板狀偽足的形成、參與血管生成、抑制硬胃癌細(xì)胞的腹膜擴(kuò)散、調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的趨化性和粘附相關(guān)過程、以及參與神經(jīng)突生長等。為了更清晰的了解ARAP3是如何特異性識別RhoA，我們解析了ARAP3的Rho

3、GAP結(jié)構(gòu)域與RhoA· GDP· AlF4-在反應(yīng)過渡態(tài)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。ARAP3的RhoGAP結(jié)構(gòu)域由9個長的α螺旋和2個短的α螺旋反向平行折疊組成。我們對復(fù)合物結(jié)構(gòu)提供的作用界面上的氨基酸進(jìn)行突變，并通過細(xì)胞外ITC實驗以及酶動力學(xué)實驗研究了這些氨基酸對RhoGAP結(jié)構(gòu)域識別RhoA以及加速RhoA-GTP水解能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)對ARAP3的氨基酸的Arg-942、Arg-949、Arg-982或Arg-985的單點突變都可以

4、顯著的降低ARAP3-RhoGAP結(jié)構(gòu)域與RhoA-GTP的結(jié)合能力以及GAP活性。我們還發(fā)現(xiàn)ARAP3是通過RhoA的α3螺旋中的氨基酸Asp-90和Glu-97來選擇RhoA作為特異性作用底物的。
　　本論文的第二章介紹了我們關(guān)于擬南芥中的PUF蛋白質(zhì)APUM23特異性識別18S核糖體RNA中11個核苷酸的5'-GGAAUUGACGG-3'序列的結(jié)構(gòu)與功能研究。多年來PUF蛋白質(zhì)得到了廣泛的結(jié)構(gòu)與功能研究，但是我們對植物中的P

5、UF蛋白質(zhì)仍然知之甚少。大部分的PUF蛋白質(zhì)都存在于細(xì)胞質(zhì)中，它們通過結(jié)合信使RNA的3'非翻譯區(qū)來調(diào)控信使RNA的翻譯及定位。APUM23是少數(shù)的存在于核仁中的PUF蛋白質(zhì)，它參與調(diào)節(jié)前核糖體RNA的加工過程，然而其中的分子機(jī)制目前尚不清楚。我們解析了APUM23和目的RNA的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，這是第一個解析出的植物中的PUF蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，APUM23是由10個Puf repeat串聯(lián)結(jié)構(gòu)域折疊成的C型結(jié)構(gòu)，APUM23有一段插入序列并在

6、C型結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)折疊成α螺旋。這段插入序列參與RNA的識別。最后，我們還解析了不含插入氨基酸序列的APUM23的突變體和RNA5'-GGAAUUGACGG-3'的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。這個復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示，G0的堿基不再與APUM23的第十個Puf repeat結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而是經(jīng)過大角度的翻轉(zhuǎn)和A+3的堿基形成堆積相互作用穩(wěn)定A+3堿基的構(gòu)象。插入氨基酸序列的存在會通過空間位阻限制G0堿基的翻轉(zhuǎn)，因此APUM23的插入氨基酸序列既識別RNA的堿基，