基于RNA-Seq的哮喘小鼠氣管平滑肌組織轉(zhuǎn)錄組分析及小鼠氣管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定.pdf

1、哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，由于其發(fā)病原因的復(fù)雜性，目前仍不是十分清楚它的發(fā)病機(jī)制。哮喘患者的氣管平滑肌會發(fā)生大量的增殖，從而導(dǎo)致氣道狹窄。了解哮喘發(fā)生時氣管平滑肌增殖的原因也是了解哮喘的途徑之一。本文主要是研究在急性與慢性哮喘模型小鼠與其相應(yīng)正常小鼠的氣管平滑肌組織中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異，從中發(fā)現(xiàn)與急慢性哮喘有關(guān)的基因。同時檢測KDM2A基因在急性、慢性哮喘小鼠氣管平滑肌組織中RNA和蛋白的表達(dá)情況，并通過改良的組織塊貼壁法建立氣管平滑肌

2、的原代細(xì)胞。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴分離急性與慢性哮喘模型小鼠與其相應(yīng)對照小鼠的氣管平滑肌組織，用于RNA-Seq測速分析，然后在篩選出急性與慢性哮喘模型小鼠中的差異表達(dá)基因之后，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，包括GO功能顯著性富集分析、KEGG信號通路網(wǎng)絡(luò)分析與Pathway顯著性富集分析等詳細(xì)深入的分析方法，對這些篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能、細(xì)胞組分分布與所述信號通路的分類。最終確定與急性與慢性哮喘有關(guān)的預(yù)警基因。其次，通過Rea

3、l-time PCR及Western blotting檢測KDM2A基因在急性、慢性小鼠氣管平滑肌組織中RNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。在這同時，還進(jìn)行了急性、慢性小鼠肺組織的切片、HE染色及免疫組化。最后，運(yùn)用改良后的組織塊貼壁法建立了氣管平滑肌的原代細(xì)胞，并用MTT法測量了氣管平滑肌原代細(xì)胞的生長曲線。⑵在RNA-Seq測序分析中，急性哮喘模型小鼠與急性對照小鼠對比共篩選出相關(guān)候選基因2429個，其中上調(diào)基因1635個，下調(diào)基因794個；通過

4、對慢性哮喘模型小鼠和慢性對照小鼠的基因進(jìn)行對比，篩選出相關(guān)候選基因13537個，其中上調(diào)基因6681個，下調(diào)基因6856個。這些基因分別分布在細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、外泌體和著絲粒上。另外分子生物學(xué)實驗也證明KDM2A在急性與慢性哮喘平滑肌中的表達(dá)含量要比正常組小鼠要低，而且慢性哮喘組的小鼠比急性哮喘組的小鼠還要低。使用組織塊貼壁法所培養(yǎng)出的原代培養(yǎng)氣管平滑肌細(xì)胞，3天后細(xì)胞就可爬出，一周內(nèi)即可傳代。經(jīng)純化后，可以得到純度較高的氣管平滑肌原代細(xì)

5、胞，且細(xì)胞的生長狀況良好。⑶根據(jù)測序所得的分析結(jié)果，可以得知相對于正常小鼠，急性與慢性哮喘小鼠氣管平滑肌中有許多基因是有差異表達(dá)的。而且慢性哮喘小鼠中的差異表達(dá)基因更多一些。分子生物學(xué)實驗表明KDM2A可能是在小鼠氣管平滑肌細(xì)胞中起到降低細(xì)胞增殖速率的作用，在急性與慢性哮喘小鼠的氣管平滑肌當(dāng)中，正是由于KDM2A表達(dá)量的降低才導(dǎo)致了氣管平滑肌細(xì)胞的過度增殖，才導(dǎo)致氣管平滑肌的過度增殖、氣道的狹窄與氣道重塑。改良后的組織塊貼壁法可以在短時