基于OATPs-oatps介導(dǎo)的麥冬皂苷D肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)的分子學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　麥冬皂苷D(Ophiopogonin D, OPD)是參麥注射液的主要的活性成分之一,后者常與其他藥物聯(lián)用治療心腦血管疾病。近年來基于OATPs介導(dǎo)的中西藥相互作用屢見報(bào)道。課題前期研究發(fā)現(xiàn),大鼠分別靜脈給予參麥注射液或等同劑量的OPD后,前者血漿中OPD的濃度較高,其血/肝濃度比值可達(dá)后者給藥的5-7倍。OPD與OATPs/Oatps抑制劑聯(lián)用后,大鼠肝臟中OPD的濃度明顯減少,但血漿中OPD濃度增大,提示OPD可能

2、經(jīng)oatps介導(dǎo)攝取進(jìn)入肝臟。因此,有必要通過體外細(xì)胞模型及質(zhì)粒構(gòu)建模型進(jìn)一步深入研究OPD在肝臟攝取轉(zhuǎn)運(yùn)的分子學(xué)機(jī)制。
　　目的:
　　通過構(gòu)建大鼠原代肝細(xì)胞模型,從細(xì)胞學(xué)水平研究OPD在肝臟中的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,初步推測(cè)OPD在大鼠原代肝細(xì)胞中的攝取與 oatps的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。然后,構(gòu)建特異性高表達(dá)人 OATP1B1的質(zhì)粒并通過轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定高表達(dá)的HEK293T細(xì)胞模型,從分子學(xué)水平進(jìn)一步深入探討OPD的肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)途徑及其機(jī)制

3、,探尋并揭示中藥組分與化學(xué)藥物之間基于OATPs介導(dǎo)的相互作用及配伍機(jī)理。
　　方法:
　　1、大鼠原代肝細(xì)胞中OPD的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究
　?、倜骱徒⒋笫蟾渭?xì)胞樣本中OPD的檢測(cè)方法和樣品處理方法
　?、诮⒋笫笤渭?xì)胞模型,在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),采用臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定肝細(xì)胞的細(xì)胞活率及產(chǎn)率。
　　③考察孵育時(shí)間、細(xì)胞密度和藥物濃度對(duì)OPD攝取轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,確定最佳攝取條件,考察OPD的攝取動(dòng)力學(xué)特征,求算Vma

4、x、Km等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　?、苎芯縪atps非特異性抑制劑利福平、瑞舒伐他汀對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中OPD攝取的影響,初步推測(cè)OPD肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)與oatps介導(dǎo)的相關(guān)性。
　　⑤選用oatps特異性抑制劑甘草酸、地高辛、四溴酚酞磺酸鈉及布洛芬,分別與OPD聯(lián)用,通過分析肝細(xì)胞中OPD濃度的變化,進(jìn)一步確認(rèn)OPD在大鼠肝細(xì)胞中攝取轉(zhuǎn)運(yùn)的主要通路。
　　2、OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞中OPD的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究
　?、?/p>

5、摸索和建立HEK293T細(xì)胞樣本中OPD的檢測(cè)方法和樣品處理方法。
　?、跇?gòu)建OATP1B1*1a-GFP質(zhì)粒并感染HEK293T細(xì)胞,獲得高表達(dá)穩(wěn)定的細(xì)胞模型。
　?、塾枚∷徕c作用于OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞,誘導(dǎo)OATP1B1基因的高表達(dá),并通過瑞舒伐他汀攝取實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證誘導(dǎo)模型是否成功。
　?、苎芯?OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞中 OPD的轉(zhuǎn)運(yùn)及其動(dòng)力學(xué)特征,比較加 OATP1B1抑

6、制劑瑞舒伐他汀、利福平、四溴酚酞磺酸鈉以及甘草酸后 OPD肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)的變化,進(jìn)一步深入闡明 OPD在OATP1B1*1a-HEK293T中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠原代肝細(xì)胞中OPD的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究
　?、俳⒌拇笫蟾渭?xì)胞破碎液中 OPD的 LC-MS測(cè)定方法專屬性較好,靈敏度高,符合樣本分析測(cè)試的相關(guān)要求。
　?、谠粌刹侥z原酶灌流法獲得大鼠原代肝細(xì)胞活力大于85％,得率約為0.8-1×108/肝,符合

7、藥物攝取實(shí)驗(yàn)的要求。
　　③原代肝細(xì)胞攝取OPD在5-10 min迅速增加,10 min后達(dá)到飽和;大鼠原代肝細(xì)胞接種密度在0.25x106-2x106/ml范圍內(nèi),OPD的攝取隨著細(xì)胞密度的增加而增加;OPD濃度在1-32μΜ范圍內(nèi),其轉(zhuǎn)運(yùn)量隨藥物濃度增加而增加,當(dāng)濃度達(dá)到16μΜ時(shí),轉(zhuǎn)運(yùn)量增長(zhǎng)趨于平緩,攝取達(dá)到飽和。根據(jù)米氏方程V=Vmax×[S]/( Km+S)計(jì)算,攝取動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km值為8.10μΜ, Vmax為54.3

8、9nmol-1.min-1.mg-1protein,Vmax/Km值為6.72。
　?、懿煌瑵舛鹊娜鹗娣ニ?5、10、20μM)對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中OPD的攝取表現(xiàn)出一定的抑制作用,與對(duì)照組相比,4μM OPD的攝取分別減少了8.6%、17.42%、32.53%;8μM OPD的攝取分別減少了9.36%、25.37%、40.18%;16μM OPD的攝取分別減少了9.27%、23.61%、32.21%。利福平(0.5、1、2、8μ

9、M))對(duì)OPD在大鼠原代肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)無明顯抑制作用。與對(duì)照組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、輔atp1b2特異性抑制劑甘草酸(5、10、20、40μM)能顯著抑制OPD在大鼠原代肝細(xì)胞中的攝取,且隨著 GL濃度的增加,抑制作用加強(qiáng),肝細(xì)胞中OPD的攝取分別減少了33.53%、39.92%、51.54%、57.50%,且具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),抑制參數(shù)IC50為25.39μM。地高辛(oatp1a4特異性抑制劑

10、)、四溴酚酞磺酸鈉及布洛芬(oatp1a1特異性抑制劑)對(duì)OPD肝臟攝取幾乎無明顯抑制作用。
　　2、OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞中OPD的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究
　?、俳⒌腍EK293T細(xì)胞樣本中OPD的LC-MS測(cè)定方法專屬性較好,靈敏度高,符合樣本分析測(cè)試的相關(guān)要求。
　?、跇?gòu)建的OATP1B1*1a-GFP質(zhì)粒感染HEK293T細(xì)胞,通過陰性病毒預(yù)實(shí)驗(yàn)得出慢病毒MOI值為80時(shí),感染率可達(dá)80%以上。然后攜

11、帶OATP1B1*1a目的基因的慢病毒去感染HEK293T細(xì)胞,隨著時(shí)間和MOI值的增加,熒光增強(qiáng),提示重組細(xì)胞模型構(gòu)建成功。
　?、跲ATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞經(jīng)丁酸鈉(1 mM)誘導(dǎo)48 h后,對(duì)經(jīng)典OATP1B1底物瑞舒伐他汀的攝取相當(dāng)于未誘導(dǎo)組的2.3倍,證明模型誘導(dǎo)成功,可較好的用于下一步的OPD攝取轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。
　?、躉ATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞中OPD的攝取動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km與Vmax分別為5

12、.50μΜ與29.07 nmol.min-1.mg-1 protein。OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞中瑞舒伐他汀的攝取動(dòng)力學(xué)參數(shù) Km與 Vmax分別為24.42μΜ與15.02 nmol.min-1.mg-1 protein。通過比較Km值及Vmax可以得出,相對(duì)于瑞舒伐他汀,OPD與OATP1B1的親和力更強(qiáng),且單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)速率更快。
　　⑤不同濃度的瑞舒伐他汀(2、10、50μM)對(duì)OATP1B1*1a-HEK

13、293T細(xì)胞中 OPD的攝取有一定的抑制作用,可使細(xì)胞中 OPD的攝取分別減少8.78±6.20%,29.23±9.58%,63.94±8.04%,抑制參數(shù)IC50為36.74μM。四溴酚酞磺酸鈉和利福平對(duì)OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞中 OPD的攝取也具有抑制作用。不同濃度的四溴酚酞磺酸鈉(8、20、50μM)可使OPD的攝取分別減少3.93±8.63%,9.03±6.73%,32.42±9.43%。不同濃度的利福平(15、

14、30、60μM)可使OPD攝取減少24.77±6.09%,34.37±5.19%,52.90±5.56%,其抑制參數(shù)IC50為55.29μM。不同濃度的甘草酸(30、60、120μΜ)對(duì)OATP1B1介導(dǎo)的OPD的轉(zhuǎn)運(yùn)也有較弱的抑制作用。使OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)OPD分別減少了7.61±9.02%,18.03±2.53%,20.83±4.66%。
　　結(jié)論:
　?、俦緦?shí)驗(yàn)建立的大鼠肝細(xì)胞破碎液及HEK2

15、93T細(xì)胞樣本中OPD的LC-MS測(cè)定方法專屬性較好,靈敏度高,可用于相關(guān)樣本中OPD濃度的檢測(cè)。
　?、诒緦?shí)驗(yàn)建立的原位兩步膠原酶灌流法獲得的大鼠原代肝細(xì)胞活力較高,可用于肝細(xì)胞藥物攝取轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)制研究。
　?、郾緦?shí)驗(yàn)構(gòu)建的 OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞誘導(dǎo)模型,OATP1B1表達(dá)穩(wěn)定且活性較高,可較好的用于人源性肝細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)制研究。
　?、躉PD在大鼠原代肝細(xì)胞中能被攝取,且在加入oatps非

16、特異性抑制劑瑞舒伐他汀(oatp1b2、oatp1a1及oatp1a4競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)后,OPD的攝取明顯減少,提示大鼠原代肝細(xì)胞中OPD的攝取可能與oatps有關(guān)。進(jìn)一步研究表明,oatp1b2特異性抑制劑甘草酸(5、10、20、40μΜ)競(jìng)爭(zhēng)性抑制原代肝細(xì)胞中OPD的攝取,且隨濃度的增加,抑制作用越強(qiáng)。而利福平(oatp1a4和oatp1a1抑制劑)、地高辛(oatp1a4特異性抑制劑)、四溴酚酞磺酸鈉及布洛芬(oatp1a1抑制劑)

17、對(duì)OPD的攝取幾乎無明顯抑制作用。因此可以推斷,OPD在大鼠原代肝細(xì)胞中的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)與oatp1b2介導(dǎo)相關(guān)。
　?、軴PD在OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞中能被攝取,相對(duì)于瑞舒伐他汀,O PD與OATP1B1的親和力更強(qiáng),且單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)速率更快。OATP1B1競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑瑞舒伐他汀、四溴酚酞磺酸鈉、利福平及甘草酸均對(duì)OATP1B1*1a-HEK293T細(xì)胞中OPD的攝取有不同程度的抑制作用,進(jìn)一步提示OPD是OATP1