2型糖尿病生物標(biāo)志物microRNA-21的生物傳感新策略研究.pdf

1、目的：MicroRNA(miRNA)作為一種重要的生物標(biāo)志物，在腫瘤的早期診斷，代謝性疾病篩查，基因調(diào)控等方面都有著重要的作用，如miRNA-21在2型糖尿病、脂肪肝、結(jié)腸癌等患者的血清、尿液中異常表達(dá)，受到廣大科研工作者的關(guān)注。目前，miRNA的傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的大多基于Northern印跡雜交、基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，但這些方法耗時(shí)費(fèi)力，需要嚴(yán)格的溫度控制，并且設(shè)備要求較高，從了提高了miRNA檢測(cè)的成本與難度。本研究針對(duì)miRN

2、A檢測(cè)的現(xiàn)狀，建立了一種新的miRNA檢測(cè)策略，選取與2型糖尿病相關(guān)的miRNA-21為檢測(cè)對(duì)象。該研究策略具有快速、靈敏、低成本、易操作的特點(diǎn)，有望在臨床實(shí)踐中，為快速、低成本的檢測(cè)其他疾病的生物標(biāo)志物提供新的研究方向，具有較好的應(yīng)用前景。
　　方法：為了更好的檢測(cè)低豐度miRNA并解決異相分析檢測(cè)方法的缺陷，本研究策略采取均相反應(yīng)環(huán)境，即在同一體系內(nèi)，完成靶物質(zhì)的識(shí)別，信號(hào)擴(kuò)增與放大，均相分析具有更為均一的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)特

3、點(diǎn)，從而最大程度保留了識(shí)別分子的親和力和特異性?；贙F exo-聚合作用和T7 pol的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增作用，靶物質(zhì)miRNA-21與本研究設(shè)計(jì)的多功能直鏈上對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，在核酸底物、KF聚合酶(KF exo-)、對(duì)應(yīng)模板鏈存在下即可發(fā)生鏈的聚合延伸，延伸出的DNA核酸序列中含有T7 RNA聚合酶(T7 pol)可特異性識(shí)別的 T7啟動(dòng)子；T7 RNA聚合酶具有高效催化轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)，能夠在單鏈或雙鏈核酸上沿5’-3’方向在其啟動(dòng)子下

4、游催化聚合出RNA片段，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增。擴(kuò)增出來的大量短鏈RNA片段與金電極表面上的檢測(cè)及捕獲探針進(jìn)行特異性結(jié)合，從而在電化學(xué)生物傳感技術(shù)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)電信號(hào)的放大并檢測(cè)，從而完成靶物質(zhì)miRNA-21的定量檢測(cè)。
　　結(jié)果：成功實(shí)現(xiàn)了靶物質(zhì)miRNA-21的定量檢測(cè)，所構(gòu)建的生物傳感技術(shù)最低檢測(cè)限約為0.6fM，線性檢測(cè)范圍為1fM到10nM，構(gòu)建的生物傳感器具有較高的敏感性；在具有高度序列相似性的miRNA中，能夠較好的區(qū)分單堿基

5、錯(cuò)配、雙堿基錯(cuò)配的靶物質(zhì)，具有較高的特異性；在實(shí)際樣本的檢測(cè)中，我們將HepG2細(xì)胞株中提取的總RNA檢測(cè)對(duì)象，在較為復(fù)雜的檢測(cè)環(huán)境中，依然能夠完成miRNA-21的定量檢測(cè)，該傳感器具有一定的抗干擾能力，穩(wěn)定性較好。
　　結(jié)論：本研究基于均相反應(yīng)環(huán)境，結(jié)合KF exo-的聚合與T7 pol的轉(zhuǎn)錄特性構(gòu)建出均相靶識(shí)別轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的生物傳感放大策略。該策略避免了序列之間的非均相聚合作用與復(fù)雜的操作步驟，具有高靈敏度，高特異性，低成本，易