細(xì)胞粘附分子3(CADM3)在缺氧肺血管特異性炎細(xì)胞粘附中的作用.pdf

1、目的:
　　缺氧是許多疾病的致病因素，也是臨床常見的病理過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吸入氣體氧分壓或氧濃度下降時，外周血來源的單核細(xì)胞（CD45+/CD11b+）在肺部的浸潤顯著增多，尤其在肺血管周圍的聚集最為廣泛；同時，肺組織中可以檢測到大量炎癥介質(zhì)的合成和分泌。越來越多的研究表明，這些炎細(xì)胞和炎癥因子是促進(jìn)缺氧性肺動脈高壓（Hypoxic pulmonary hypertension,HPH）發(fā)生發(fā)展的重要因素。有意思的是，在同樣的

2、實(shí)驗(yàn)條件下，體循環(huán)血管周圍沒有檢測到類似的炎癥反應(yīng)。CADM3（cell adhesion molecular3）作為一種類免疫球蛋白粘附分子，屬于Nectin分子樣家族蛋白，主要表達(dá)于細(xì)胞膜上。以往研究表明，CADM3是神經(jīng)組織特異表達(dá)的細(xì)胞粘附分子，對神經(jīng)元的形成具有重要作用。我們前期實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，CADM3在缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）中表達(dá)增加并

3、參與促進(jìn)單核細(xì)胞粘附。但CADM3是否介導(dǎo)肺循環(huán)特異的單核細(xì)胞浸潤，目前尚未見報道。本課題旨在研究CADM3在缺氧肺血管特異性炎細(xì)胞粘附中的作用。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)以大鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞（rat pulmonary arterial endothelial cell，RPAEC）、大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（rat aortic endothelial cell，RAEC）、人外周血單核細(xì)胞系（U937，THP-1）以及外周血白細(xì)

4、胞為研究模型，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計分組，U937粘附實(shí)驗(yàn)：常氧RPAEC+常氧 U937組（CPE+CU），缺氧RPAEC+常氧U937組（HPE+CU），缺氧RPAEC+缺氧U937組（HPE+HU），常氧RAEC+常氧U937組（CAE+CU），缺氧 RAEC+常氧 U937組（HAE+CU）和缺氧 RAEC+缺氧 U937組（HAE+HU）（n=3）；THP-1粘附實(shí)驗(yàn)：常氧RPAEC+常氧THP-1組（CPE+CT），缺氧RPAEC+常氧

5、THP-1（HPE+CT），缺氧RPAEC+缺氧THP-1組（HPE+HT），常氧RAEC+常氧THP-1組（CAE+CT），缺氧RAEC+常氧THP-1組（HAE+CT）和缺氧RAEC+缺氧THP-1組（HAE+HT）（n=3）。缺氧處理（1%O2）組細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)6h，常氧對照（21%O2）組細(xì)胞置于普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)至相應(yīng)時間。
　　1.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DiI+細(xì)胞比例；熒光定量酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞裂解液中熒光值；倒置顯

6、微鏡觀察細(xì)胞粘附并計數(shù)。
　　2.采用免疫印跡法檢測CADM3，HIF-1α蛋白表達(dá)差異；采用免疫熒光染色觀察CADM3和p65蛋白表達(dá)及其分布。
　　3.采用抗CADM3抗體封閉和流式細(xì)胞檢測術(shù)，檢測DiI+細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:
　　1.缺氧對內(nèi)皮細(xì)胞與U937細(xì)胞粘附影響：流式檢測結(jié)果與熒光酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示，HPE+CU組DiI+細(xì)胞比例以及細(xì)胞裂解液中熒光值顯著增加，與CPE+CU組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)

7、意義（P＜0.05）；HPE+HU組與HPE+CU組相比，兩組間無差異；RAEC與U937粘附各組間無差異。倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，HPE+CU組與CPE+CU組相比，U937細(xì)胞粘附率，內(nèi)皮細(xì)胞粘附力均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雖內(nèi)皮細(xì)胞粘附率相應(yīng)增高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。HPE+HU組與HPE+CU組相比，各指標(biāo)差異無顯著性意義。
　　2.缺氧促進(jìn)RPAEC與THP-1細(xì)胞、外周血CD11b+白細(xì)胞粘附：分

8、別采用流式細(xì)胞術(shù)與熒光定量酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。流式結(jié)果顯示，HPE+CT組與CPE+CT組相比，DiI+細(xì)胞比例顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HPE+HT組與HPE+CT組相比，兩組間無差異；RAEC與THP-1粘附實(shí)驗(yàn)各組間差異均無顯著意義。熒光定量酶標(biāo)儀結(jié)果顯示，缺氧RPAEC+外周血白細(xì)胞組與常氧RPAEC+外周血白細(xì)胞組相比，細(xì)胞裂解液中CD11b+熒光強(qiáng)度明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而其他類型白細(xì)

9、胞不具有此特性。另外，RAEC與外周血白細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，各組間細(xì)胞裂解液熒光強(qiáng)度無明顯差異。
　　3.采用免疫印跡和免疫熒光染色檢測 CADM3表達(dá)水平，缺氧RPAEC組與常氧RPAEC組相比，CADM3表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。常氧RPAEC+LPS組與常氧 RPAEC組比較以及缺氧RPAEC+LPS組與缺氧RPAEC組相比，CADM3表達(dá)均無明顯差異。RAEC各組間CADM3表達(dá)無明顯差異。
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10、.采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察p65蛋白定位，結(jié)果顯示，常氧RPAEC組與缺氧RPAEC組中，p65蛋白主要位于細(xì)胞胞漿；常氧RPAEC+LPS（5ug/ml）組與缺氧RPAEC+LPS（5ug/ml）組中，p65蛋白主要位于細(xì)胞胞核。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測抗CADM3抗體封閉對缺氧條件下RPAEC與U937粘附的影響，結(jié)果顯示，缺氧+抗CADM3抗體組與缺氧組相比，DiI+細(xì)胞比例顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。