MFGE8在肝炎-肝硬化-肝癌疾病進(jìn)展中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、在肝炎-肝纖維化/肝硬化-肝癌的疾病進(jìn)展過(guò)程中，病毒感染、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝炎和肝毒性物質(zhì)等各種損傷因素引起肝細(xì)胞壞死或凋亡，通過(guò)自分泌和旁分泌等方式釋放細(xì)胞因子，激活肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）和Kupffer細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的慢性化。肝纖維化是炎癥刺激和損傷修復(fù)的早期階段，具有一定的可逆性，當(dāng)去除致病因素時(shí)，活化的肝星狀細(xì)胞發(fā)生凋亡，膠原沉積減少，肝組織結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。如果損傷和慢性炎癥

2、持續(xù)，最終可進(jìn)展為肝硬化和肝癌。
　　細(xì)胞因子是一類由免疫原等刺激原誘導(dǎo)產(chǎn)生可溶性的分泌蛋白，可以來(lái)源于多種細(xì)胞，通過(guò)旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式發(fā)揮作用，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)等多種功能，并形成復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與機(jī)體很多重要的生理功能。乳脂球表皮生長(zhǎng)因子8（milk fat globule-epidermal growth factor-factor8，MFGE8）是一種親脂性糖蛋白，

3、廣泛參與細(xì)胞間的相互作用，在炎癥損傷、纖維化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種疾病中發(fā)揮重要作用。
　　本課題的研究目標(biāo)是篩選肝炎-肝纖維化-肝癌疾病進(jìn)展中關(guān)鍵的細(xì)胞因子，并研究其功能，分為以下三個(gè)部分：
　　第一部分、肝炎-肝纖維化-肝癌疾病進(jìn)展相關(guān)細(xì)胞因子的篩選
　　用四氯化碳（ carbon tetrachloride， CCl4）和N-亞硝基二乙胺/苯巴比妥（N-diethylnitrosamine/phenobarbita

4、l，DEN/PB）分別誘導(dǎo)C3H雄性小鼠，收集CCl4誘導(dǎo)2周、6周、8周，DEN誘導(dǎo)2月、5月、8月以及健康小鼠的血清（每組5只），用定制的細(xì)胞因子芯片進(jìn)行篩選，分析肝纖維化和肝癌疾病進(jìn)展過(guò)程中升高趨勢(shì)最明顯的4個(gè)因子，用小鼠肝組織進(jìn)行real-time PCR初步驗(yàn)證。結(jié)果顯示，TGF-β在肝纖維化中輕度升高，在CCl4誘導(dǎo)2周后升高1.7倍（P＜0.01）；chordin的變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；prostasin在肝癌過(guò)程中顯著升高

5、，在DEN誘導(dǎo)2月、5月、8月后分別升高2.7倍、5.4倍和2.5倍（P＜0.01）；MFGE8在肝纖維化中顯著升高，在CCl4誘導(dǎo)2周、6周、8周后分別升高3.8倍、3.3倍和3.4倍（p＜0.001），在肝癌過(guò)程中有逐漸升高趨勢(shì)，在DEN誘導(dǎo)2月、5月、8月后分別升高1.1倍、1.6倍和2.3倍，提示MFGE8可能在肝炎-肝纖維化-肝癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有必要對(duì)其功能予以深入研究。
　　第二部分、MFGE8在急性肝損傷小

6、鼠模型和肝纖維化小鼠模型中的表達(dá)
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證MFGE8的表達(dá)，我們構(gòu)建了CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型和肝纖維化小鼠模型，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析。研究發(fā)現(xiàn)，在急性肝損傷小鼠模型和肝纖維化小鼠模型中，MFGE8的表達(dá)均升高，主要在肝細(xì)胞的細(xì)胞漿中表達(dá)。ELISA結(jié)果表明，在急性肝損傷小鼠模型中，血清MFGE8表達(dá)顯著升高（p＜0.001），在第1天達(dá)到峰值，然后逐漸降低，第6天降低至正常水平；而在肝纖維化小鼠模型中，MF

7、GE8表達(dá)隨著誘導(dǎo)時(shí)間逐漸增多（p＜0.001）。Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在急性肝損傷小鼠模型中，MFGE8 mRNA水平在CCl4誘導(dǎo)3天后升高4.4倍（p＜0.001），在肝纖維化小鼠模型中，MFGE8 mRNA水平在CCl4誘導(dǎo)2周和6周分別升高4.2倍和5.0倍（p＜0.001）。Western blot結(jié)果也證實(shí)MFGE8的表達(dá)是升高的。為了進(jìn)一步證明MFGE8是肝細(xì)胞釋放的，我們分離并培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

8、，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，上清中MFGE8表達(dá)逐漸升高，與對(duì)照組相比，CCl4刺激使MFGE8表達(dá)進(jìn)一步增加，real-time PCR和western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CCl4刺激上調(diào)MFGE8的表達(dá)（P＜0.05）。CCl4刺激原代肝細(xì)胞后，Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)升高，而外源性補(bǔ)充MFGE8治療后，Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)下降，提示MFGE8有抗凋亡作用。LX-2細(xì)胞給予不同濃度的人重組MFGE8蛋白刺激后，活化

9、程度呈濃度依賴的下降，提示MFGE8在肝纖維化進(jìn)展中抑制LX-2細(xì)胞的活化。在肝癌細(xì)胞Huh-7中干涉MFGE8蛋白表達(dá)后，Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)升高，提示MFGE8在肝癌細(xì)胞Huh-7中有抗凋亡的作用。
　　第三部分、MFGE8在肝炎-肝纖維化-肝癌中的臨床意義
　　利用正常人組織芯片對(duì) MFGE8在人體主要組織的表達(dá)分布情況進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MFGE8廣泛表達(dá)在上皮來(lái)源的細(xì)胞中。為了進(jìn)一步探索MF

10、GE8在肝炎-肝纖維化-肝癌中的臨床意義，我們收集肝炎、肝硬化、肝癌患者和正常人的血清與肝組織樣本，進(jìn)行ELISA和免疫組織化學(xué)染色，觀察MFGE8在臨床樣本中的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，MFGE8主要表達(dá)在肝細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，MFGE8在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)降低（P＜0.01）。ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝炎患者血清中MFGE8表達(dá)升高（P＜0.01），在肝硬化和肝癌患者血清中MFGE8表達(dá)下降，提示MFGE8可能是肝炎-肝纖維化-