神經(jīng)元-星形膠質(zhì)可塑性在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙中的作用.pdf

1、第一部分、FGF2調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞GLAST在PTSD治療中的作用及機(jī)制
　　目的：FGF2是一種重要的具有神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化作用的有絲分裂原。以往研究報(bào)道FGF2可以改善SPS后星形膠質(zhì)細(xì)胞的失活，但是其作用的分子機(jī)制尚不明確。GLAST/GLT-1是與認(rèn)知相關(guān)的表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的重要谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外谷氨酸濃度和神經(jīng)元存活。本實(shí)驗(yàn)旨在探討FGF2調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST和GLT-1、改善SP

2、S模擬的PTSD樣行為的作用及機(jī)制。
　　方法：成年雄性SD大鼠（250-300g，8周齡）70只隨機(jī)分為對(duì)照組（n=15），SPS（n=25），SPS+FGF2（n=15）以及SPS+FGF2+AG490（JAK/STAT抑制劑，n=15）組，SPS、經(jīng)腹腔給予FGF2（20mg/kg·day）和AG490（10mg/kg·day）處理。SPS后第7天至第28天行恐懼行為測(cè)試，第7/14/28天行曠場(chǎng)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)

3、驗(yàn)結(jié)束后取材進(jìn)行高效液相色譜、免疫熒光染色和Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)腦脊液谷氨酸濃度、海馬GFAP、GLT-1、GLAST、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3及STAT3含量。離體海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞給予FGF2（30ng/mL）和AG490（50μM）處理48h，Western blot和免疫熒光染色研究蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：SPS組的大鼠在SPS7天和14天后與對(duì)照組相比，在環(huán)境恐懼記憶及

4、條件恐懼記憶中的不動(dòng)時(shí)間均顯著延長（與對(duì)照組相比，P＜0.01）。在SPS14天后，SPS+FGF2組大鼠的條件恐懼及環(huán)境恐懼記憶不動(dòng)時(shí)間均比SPS-14 day組顯著縮短（P＜0.01）。該治療效應(yīng)被AG490阻斷（與SPS+FGF2組相比，P＜0.05）。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)GF2顯著改善了SPS大鼠誘導(dǎo)的焦慮樣行為，具體表現(xiàn)為與對(duì)照組相比，SPS-7 day和-14day組大鼠曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離和滯留時(shí)間縮短（P＜0

5、.01），與SPS組相比，SPS+FGF2組大鼠的上述兩指標(biāo)延長（P＜0.01），與SPS+FGF2組相比，SPS+FGF2+AG490組曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離（P＜0.05）和滯留時(shí)間（P＜0.01）均明顯縮短；在高架十字迷宮中，與對(duì)照組相比，SPS大鼠開臂滯留時(shí)間百分比和進(jìn)入次數(shù)百分比均減少（P＜0.01），與SPS組相比，SPS+FGF2組兩項(xiàng)指標(biāo)增加（P＜0.01），與SPS+FGF2組相比，SPS+FGF2+AG490組兩項(xiàng)指標(biāo)均

6、明顯縮短（P＜0.05）。HPLC實(shí)驗(yàn)和Western blot，免疫熒光染色分別用于檢測(cè)腦脊液中谷氨酸的含量及海馬谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、JAK/STAT信號(hào)蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比，SPS組大鼠腦脊液中谷氨酸濃度升高（P＜0.01），海馬GFAP、GLAST及GLT-1表達(dá)降低（P＜0.01），同時(shí)p-JAK1、p-JAK2、及p-STAT3表達(dá)降低（P＜0.01）；與SPS組相比，SPS+FGF2組腦脊液谷氨酸含量降低（P＜0.01），海馬

7、GFAP表達(dá)升高（P＜0.01），GLAST上調(diào)（P＜0.01），GLT-1表達(dá)增加（P＜0.05），同時(shí)p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3表達(dá)升高（P＜0.01）；AG490逆轉(zhuǎn)了FGF2的分子生物學(xué)效應(yīng)，與SPS+FGF2組相比，SPS+FGF2+AG490組腦脊液谷氨酸再次升高（P＜0.05），海馬GFAP、GLAST、p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3均降低（P＜0.05）。FGF2處理離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GF

8、AP、GLAST、GLT-1、p-JAK1、p-JAK2及p-STAT3表達(dá)增加（與對(duì)照組相比，P＜0.05），AG490處理離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上述分子表達(dá)減少（與對(duì)照組相比，P＜0.05），同時(shí)給予FGF2和AG490，星形膠質(zhì)細(xì)胞上述分子表達(dá)不變。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPS會(huì)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的JAK/STAT通路活性，從而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，進(jìn)而引起谷氨酸穩(wěn)態(tài)失衡，擾亂中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性-抑制性神經(jīng)傳遞的平衡，

9、進(jìn)而引起PTSD樣癥狀；相反，F(xiàn)GF2通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮治療PTSD的作用。
　　第二部分、Trk/ERK/CREB介導(dǎo)的神經(jīng)元突觸可塑性與NGF治療PTSD作用機(jī)制研究
　　目的：NGF是臨床上廣泛使用的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，研究表明，PTSD患者存在NGF表達(dá)的異常。神經(jīng)可塑性改變構(gòu)成應(yīng)激相關(guān)障礙共同的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)在之前實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立小鼠SPS動(dòng)物模型，旨在研究NGF能否影響SPS誘

10、導(dǎo)的PTSD樣行為，改善SPS誘導(dǎo)的神經(jīng)突觸可塑性改變，及其潛在的分子機(jī)制：是否依賴于ERK/CREB信號(hào)通路的激活。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一：75只成年雄性C57小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，SPS-3 day，SPS-7 day， SPS-14 day，SPS-28 day組（每組15只），檢測(cè)p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synaptophysin在不同靜止期過后的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二：105只成年雄性C

11、57小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，SPS組以及SPS+0.3，SPS+1.0，SPS+3.0，SPS+10.0以及SPS+30.0（μg/kg·day NGF）劑量組（每組15只）。各組檢測(cè)環(huán)境恐懼和條件恐懼不動(dòng)時(shí)間，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)海馬p-CREB的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)三：60只成年雄性C57小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，SPS-14 day組，SPS-14 day+生理鹽水組，以及SPS-14 day+NGF（10μg/kg·da

12、y）組（每組15只），檢測(cè)動(dòng)物行為學(xué)、形態(tài)學(xué)改變以及p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synap等蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)四：離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元給予NGF（50ng/mL）和PD98059（MEK1抑制劑，20μM）處理48 h，觀察神經(jīng)元形態(tài)和分子生物學(xué)改變。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，SPS誘導(dǎo)小鼠環(huán)境恐懼記憶和條件恐懼記憶實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長（P＜0.01），NGF劑量依賴性地縮短恐懼記憶不動(dòng)時(shí)間，其減輕環(huán)境恐懼記憶

13、和條件恐懼記憶的半數(shù)有效劑量（effective dose50％）分別為1.935μg/kg·day和1.873μg/kg·day。本實(shí)驗(yàn)參照臨床上NGF的用藥劑量、NGF處理SPS小鼠的劑量-效應(yīng)曲線以及ED50，滴定NGF濃度為3.0μg/kg·day。3.0μg/kg·day NGF處理能夠改善SPS誘導(dǎo)的焦慮樣行為：在EPMT中，與對(duì)照組相比，SPS組的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比減小，而閉臂進(jìn)入次數(shù)百分比和閉臂滯留時(shí)

14、間百分比增大（P＜0.01）；與SPS組相比，SPS+NGF組的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比增加（P＜0.01），閉臂進(jìn)入次數(shù)百分比（P＜0.05）和閉臂滯留時(shí)間百分比減?。≒＜0.01）；在OFT，SPS組的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離和滯留時(shí)間減少（與對(duì)照組相比，P＜0.01）；與SPS組相比，SPS+NGF組的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離和滯留時(shí)間增加（P＜0.05）；對(duì)照組、SPS組和SPS+NGF組的總運(yùn)動(dòng)距離和速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示SPS

15、和NGF對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能無影響。Golgi染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SPS組小鼠海馬神經(jīng)元基樹突和頂樹突總長度縮短（P＜0.01），基樹突和頂樹突突起數(shù)目及分枝數(shù)目減少（P＜0.05），同時(shí)樹突棘密度減少（P＜0.01）；NGF逆轉(zhuǎn)了SPS誘導(dǎo)的突觸可塑性改變，與SPS組相比，SPS+NGF組小鼠海馬神經(jīng)元基樹突和頂樹突總長度延長（P＜0.05），基樹突和頂樹突突起數(shù)目及分枝數(shù)目增加（P＜0.05），同時(shí)樹突棘密度增加（P＜0.01）

16、。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SPS組的海馬p-Trk、p-ERK、p-CREB、PSD95及Synaptophysin隨著靜止期的延長不斷減少，在SPS-14 day降至最低水平（P＜0.05），選取14天為SPS后靜止期，給予NGF處理后，上述蛋白表達(dá)恢復(fù)如常（與SPS組相比，P＜0.05）。離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了NGF對(duì)于神經(jīng)可塑性和突觸相關(guān)蛋白影響以及可能的分子機(jī)制：與對(duì)照組相比，NGF組的樹突分枝數(shù)目及總長度

17、顯著增加（P＜0.01），PD98059組的樹突分枝數(shù)目及總長度減少（P＜0.05）；與PD98059組相比，NGF+PD98059組上述兩項(xiàng)指標(biāo)增加至正常水平（P＜0.05），說明NGF通過逆轉(zhuǎn)PD98059對(duì)海馬神經(jīng)元ERK通路的抑制作用改善突觸可塑性；與對(duì)照組相比，NGF組p-Trk，p-ERK，p-CREB，MAP2表達(dá)增加（P＜0.05），PD98059降低了海馬神經(jīng)元ERK和CREB的磷酸化水平及MAP2表達(dá)（與對(duì)照組相比，

18、P＜0.05），該效應(yīng)被NGF逆轉(zhuǎn)（與PD98059組相比，P＜0.05）。
　　結(jié)論：NGF通過激活海馬ERK/CREB信號(hào)通路改善SPS誘導(dǎo)的突觸可塑性損害，減輕PTSD樣行為學(xué)改變。
　　第三部分、PTEN/Akt通路介導(dǎo)的ACC神經(jīng)元突觸可塑性增強(qiáng)與rTMS治療PTSD機(jī)制相關(guān)性研究
　　目的：rTMS是一種新型的物理治療手段，臨床上正逐步推廣用于精神疾病的治療。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，rTMS有效緩解大鼠SPS處

19、理誘導(dǎo)的PTSD動(dòng)物模型的焦慮樣行為，但是rTMS是否對(duì)其恐懼行為具有緩解作用以及rTMS治療PTSD深層次的分子機(jī)制尚未探明。本實(shí)驗(yàn)立足于現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)，結(jié)合臨床影像學(xué)研究結(jié)果，觀察了rTMS對(duì)SPS模型前扣帶回（ACC）谷氨酸能神經(jīng)傳遞及突觸可塑性的影響，以及介導(dǎo)rTMS作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)首先研究了不同靜止期（7day/14day）、高頻rTMS（HrTMS，15Hz）和低頻rTMS（LrTMS，1Hz）對(duì)SP

20、S大鼠ACC谷氨酸受體表達(dá)的影響，60只成年雄性SD大鼠（250-300g,8周齡）隨機(jī)分為對(duì)照組（rTMS假刺激，sham，n=12）, SPS-7d組（n=12）,SPS-14d組（n=12）, SPS+HrTMS（n=12）以及SPS+LrTMS組（n=12），由于檢測(cè)14 day靜止期對(duì)谷氨酸受體表達(dá)影響最為顯著，SPS處理7天靜止期后給予rTMS連續(xù)處理7天（每天1次）。48只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、siPTEN組、bpV組、

21、wortmannin組（每組12只），檢測(cè) ACC區(qū)域PTEN和p-Akt表達(dá)。為了檢測(cè)HrTMS是否通過PTEN/Akt信號(hào)通路改善SPS處理后ACC谷氨酸受體表達(dá)、突觸可塑性及行為學(xué)改變，96只SD大鼠隨機(jī)分為sham(n=16)，SPS(n=16)，SPS+HrTMS(n=16)，SPS+HrTMS+bpV(n=16),SPS+HrTMS+siPTEN(n=16)及SPS+HrTMS+wortmannin(Akt抑制劑，n=16)

22、組。rTMS干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行OFT，EPMT，恐懼箱實(shí)驗(yàn)（fear conditioning test,FCT）以及前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)（prepulse inhibition，PPI）。采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組谷氨酸受體、PTEN、p-Akt、Akt等分子的表達(dá)；采用免疫熒光染色雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記檢測(cè)ACC神經(jīng)元中NR2B、GluR1及p-Akt表達(dá)。采用Golgi染色技術(shù)研究各組神經(jīng)元突觸可塑性的改變。
　　結(jié)果：Weste

23、rn blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SPS-7d組、SPS-14d組SPS+LrTMS組和SPS+HrTMS組ACC中NR1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2、GluR3及GluR4表達(dá)降低（P＜0.05），與SPS-14d組相比，SPS+HrTMS組上述分子表達(dá)增加（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，SPS-7d組和SPS-14d組ACC區(qū)PTEN表達(dá)增加，p-Akt表達(dá)減少（P＜0.01），HrTMS而非LrTMS逆轉(zhuǎn)了

24、上述改變：與SPS-14d組相比，SPS+HrTMS組PTEN表達(dá)減少，p-Akt表達(dá)增加（P＜0.05）。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，其他4組ACC中GluR1及NR2B表達(dá)降低（P＜0.05），與SPS-14d組相比，SPS+HrTMS組GluR1及NR2B表達(dá)增加（P＜0.05）。NeuN染色進(jìn)一步證實(shí)，受SPS和HrTMS調(diào)控的p-Akt位于神經(jīng)元中。定位注射給予bpV、siPTEN及wortmannin后，大鼠AC

25、C區(qū)域神經(jīng)元PTEN、p-Akt有相應(yīng)的改變：與對(duì)照組相比，siPTEN組 PTEN表達(dá)降低（P＜0.01），bpV和siPTEN組p-Akt升高（P＜0.01），wortmannin組p-Akt降低（P＜0.01）。在SPS、HrTMS基礎(chǔ)上給予bpV、siPTEN及wortmannin處理發(fā)現(xiàn)，siPTEN和bpV增強(qiáng)了HrTMS的效應(yīng)，而wortmannin阻斷了HrTMS的效應(yīng)：與SPS+HrTMS組相比，SPS+HTMS+si

26、PTEN組和SPS+HrTMS+bpV組p-Akt、NR2B、GluR1表達(dá)增加（P＜0.05），SPS+HrTMS+wortmannin組p-Akt、NR2B、GluR1表達(dá)降低（P＜0.01）。Golgi染色顯示：與對(duì)照組相比，SPS組ACC神經(jīng)元樹突總長度、樹突分枝數(shù)目、樹突棘密度均減?。≒＜0.01）；與SPS組相比，SPS+HrTMS組上述指標(biāo)增加（P＜0.05）；與SPS+HrTMS組相比，SPS+HrTMS+bpV組樹突總

27、長度、樹突分枝數(shù)目、樹突棘密度進(jìn)一步增加（P＜0.05），SPS+HrTMS+wortmannin組頂樹突樹突總長度、樹突分枝數(shù)目、頂樹突和基樹突樹突棘密度均減?。≒＜0.05）。FCT顯示，與對(duì)照組相比，SPS組環(huán)境恐懼記憶及條件恐懼記憶實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長（P＜0.01），與SPS組相比，SPS+HrTMS組不動(dòng)時(shí)間縮短（P＜0.05），與SPS+HrTMS組相比，SPS+HrTMS+bpV組不動(dòng)時(shí)間縮短（P＜0.05）SPS+HrTM

28、S+wortmannin組不動(dòng)時(shí)間延長（P＜0.05）。EPMT中，與對(duì)照組相比，SPS組開臂進(jìn)入次數(shù)和開臂滯留時(shí)間百分比減少（P＜0.01），與SPS組對(duì)比，SPS+HrTMS組上述指標(biāo)增大（P＜0.05），與SPS+HrTMS組對(duì)比，SPS+HrTMS+bpV組開臂滯留時(shí)間百分比增大（P＜0.05），SPS+HrTMS+wortmannin組開臂進(jìn)入次數(shù)和開臂滯留時(shí)間百分比減少（P＜0.05）。OFT中，與對(duì)照組相比，SPS組中央?yún)^(qū)

29、運(yùn)動(dòng)距離和滯留時(shí)間百分比減少（P＜0.01），與SPS組對(duì)比，SPS+HrTMS組上述指標(biāo)增大（P＜0.05），與SPS+HrTMS組對(duì)比，SPS+HrTMS+bpV組中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間百分比增大（P＜0.05），SPS+HrTMS+wortmannin組中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離和滯留時(shí)間百分比減少（P＜0.05）。PPI實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，SPS組PPI指數(shù)減小（P＜0.01），與SPS組對(duì)比，SPS+HrTMS組PPI指數(shù)增大（P＜0.05），