乳鏈菌肽抗性蛋白突變體的表達(dá)對(duì)乳鏈菌肽產(chǎn)量的影響.pdf

1、乳鏈菌肽(nisin)是由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)產(chǎn)生的含有34個(gè)氨基酸的陽(yáng)離子抗菌多肽，屬于第一類(lèi)羊毛硫細(xì)菌素，可有效抑制包括多種食物腐敗菌和病原菌在內(nèi)的革蘭氏陽(yáng)性菌，并可被人體產(chǎn)生的a-胰凝乳蛋白酶有效降解，對(duì)人體安全無(wú)毒，是目前唯一大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用的高效天然食品防腐劑。
　　 在nisin產(chǎn)生菌中，nisin的抗性（免疫）是由nisI編碼的脂蛋白(NisI)和nisFEG編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)

2、合體(NisFEG)共同決定的；然而，在一些不產(chǎn)nisin的L.lactis中，nisin抗性則是由nisin抗性基因（nisin resistance gene，nsr）編碼的一個(gè)分子量約為35kDa的nisin抗性蛋白(NSR)決定的。本研究通過(guò)基因工程的手段，采用定點(diǎn)突變的方法將nisin抗性基因nsr進(jìn)行突變，并對(duì)突變后的抗性基因編碼的蛋白生理功能進(jìn)行了研究，根據(jù)其特有的生理功能又將該突變體蛋白在nisin產(chǎn)生菌中進(jìn)行克隆與表達(dá)

3、。研究取得了如下結(jié)果：
　　 1)nisin抗性基因nsr的定點(diǎn)突變：對(duì)基因nsr編碼蛋白NSR的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其第236位絲氨酸在所有末端特異性蛋白酶中均保守，可能為其活性中心。因此將NSR第236位絲氨酸突變?yōu)楸彼?記為NSRS236A)。
　　 2)抗性蛋白突變體NSRS236A的生理功能研究：本文構(gòu)建了表達(dá)NSRS236A的L.lactis MG1363重組菌株，用以研究該蛋白的生理功能。Wester

4、n blot雜交結(jié)果顯示，和NSR一樣，NSRS236A特異性定位于細(xì)胞膜上；肽釋放實(shí)驗(yàn)表明突變體NSRS236A不再具備有降解nisin的功能；表面等離子共振檢測(cè)表明NSRS236A能與nisin結(jié)合。
　　 3)NSRS236A的表達(dá)對(duì)nisin產(chǎn)量的影響：利用nisin抗性蛋白突變體NSRS236A可以結(jié)合nisin分子而不會(huì)對(duì)其行使降解功能的特點(diǎn)，將帶有強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P59的抗性基因nsr S36A克隆到nisin表達(dá)質(zhì)

5、粒pHJ201上，將重組質(zhì)粒引入L．lactis NZ9800中，使nsr S36A基因得以表達(dá)，比較重組菌株L.lactis NZ9800/pHM582與對(duì)照菌株L.lactis NZ9800/pHJ201的生長(zhǎng)曲線、對(duì)nisin的抗性水平、抑菌活性及nisin產(chǎn)量的差異。結(jié)果表明NSRS236A的表達(dá)對(duì)重組菌的生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯的影響，但卻能促使重組菌株對(duì)nisin的抗性水平提高40％，對(duì)指示菌Mflavus NCIB8166抑菌活性

6、在6h和8h時(shí)明顯增強(qiáng)，nisin的表達(dá)量分別提高1.9倍和27％。
　　 本項(xiàng)研究結(jié)果突出地表現(xiàn)在：定位于細(xì)胞膜上的NSRS236A通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面nisin分子，在細(xì)胞表面阻止nisin對(duì)自身菌體的破壞，增強(qiáng)了菌體對(duì)nisin的抗性水平，提高了nisin的表達(dá)量。
　　 以上結(jié)果說(shuō)明nisin抗性蛋白突變體NSRS236A的表達(dá)可以提高產(chǎn)生菌對(duì)nisin的抗性，從而提高nisin產(chǎn)量，為通過(guò)基因工程手段提高nisin