紫草素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌衰老及分子機(jī)制.pdf

1、目的:
　　非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)，是所有肺癌病人中占比最高的類型，在全世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率都較高，是最常見的惡性腫瘤。目前關(guān)于癌癥的治療，主要通過藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮作用。然而，細(xì)胞衰老，一種能夠抑制細(xì)胞增殖的應(yīng)激反應(yīng)，它在抗腫瘤的研究中備受關(guān)注。衰老在癌前病變的組織中普遍存在，腫瘤向惡性發(fā)展必然要擺脫衰老的束縛。然而，即使是惡性腫瘤，如果能激活抑癌基因發(fā)揮

2、功能或是觸發(fā)衰老信號(hào)，惡性腫瘤仍有可能走向衰老，衰老在腫瘤發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵的屏障作用。在體內(nèi)，衰老的腫瘤細(xì)胞可通過免疫細(xì)胞或其他途徑清除，因而有效的抑制了腫瘤的惡化。目前的常規(guī)化療也具有誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的潛能，這可能是其具有抗腫瘤作用的部分原因。盡管衰老療法在動(dòng)物模型中取得了令人滿意的效果，但是要將其轉(zhuǎn)化為臨床抗腫瘤手段仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。中藥紫草已經(jīng)在中國被沿用了上千年。紫草素(Shikonin，SHK)，從紫草中分離提取分離的活性成分，

3、在臨床應(yīng)用中具有解毒，抗炎，抗腫瘤和抗病毒的作用。研究表明，紫草素具有廣泛的藥理活性，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，包括結(jié)腸癌，乳腺癌，胃癌，肺癌等。據(jù)報(bào)道，紫草素可以誘導(dǎo)A549癌細(xì)胞凋亡，壞死和早衰。然而，紫草素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞衰老的具體機(jī)制仍尚不明確。
　　基于上述研究基礎(chǔ)，本論文旨在研究紫草素對(duì)非小細(xì)胞肺癌的衰老影響及其作用機(jī)制，為紫草素新藥開發(fā)及臨床使用提供參考依據(jù)。
　　方法:
　　1.紫草素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生

4、長與增殖的抑制作用
　　采用MTT的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)紫草素作用于A549和H1299細(xì)胞24，48，72 h后對(duì)細(xì)胞活力的影響，并計(jì)算得出每種細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的IC50值。采用EdU摻入法檢測(cè)紫草素作用72h后細(xì)胞的增殖情況。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)給藥后細(xì)胞周期阻滯于哪一周期，并結(jié)合western blot實(shí)驗(yàn)方法考察紫草素對(duì)細(xì)胞周期蛋白的作用。
　　2.紫草素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞衰老的影響
　　采用β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)紫

5、草素作用細(xì)胞72 h后細(xì)胞的衰老情況，細(xì)胞染色后于熒光倒置顯微鏡下拍照，并觀察衰老細(xì)胞和正常細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞給藥結(jié)束后，DAPI染色處理，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集(SAHF)情況。
　　3.紫草素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞衰老的作用機(jī)制
　　采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)給藥后細(xì)胞內(nèi)ROS的變化，以及給藥后western blot檢測(cè)DNA損傷相關(guān)蛋白p-H2A.X、Kdm2b/H3K36me2和p53/p21waf的

6、表達(dá)情況。在加入抗氧化劑NAC預(yù)處理細(xì)胞后檢測(cè)ROS的表達(dá)水平，在ROS耗竭后考察細(xì)胞活力、細(xì)胞衰老、p53變化以及DNA損傷情況。
　　4.紫草素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌衰老與自噬、凋亡的相關(guān)性
　　采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合western blot的方法考察A549和H1299給藥處理后細(xì)胞自噬的變化。采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測(cè)紫草素處理后，細(xì)胞的凋亡情況，同時(shí)采用western blot的方法檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的

7、蛋白表達(dá)情況。
　　5.考察紫草素在體內(nèi)的抗腫瘤作用
　　建立裸鼠移植瘤模型，將A549細(xì)胞接入裸鼠腋下，待腫瘤體積達(dá)到一定大小后灌胃給紫草素溶液。持續(xù)給藥4周，每隔三天稱量體重，測(cè)量腫瘤體積，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱量腫瘤重量，β-半乳糖苷酶染色和免疫組化檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　1.紫草素使細(xì)胞生長周期阻滯于G0/G1期而抑制肺癌細(xì)胞的生長與增殖
　　細(xì)胞活力檢測(cè)顯示紫草素在24、48、72h的時(shí)間點(diǎn)都能夠

8、阻止肺癌細(xì)胞生長與增殖，并成濃度依賴性。A549和H1299細(xì)胞經(jīng)紫草素處理72h后的IC50值分別為2.28±0.19μM和0.64±0.07μM，EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紫草素可以明顯抑制A549和H1299細(xì)胞的增殖，而且細(xì)胞周期檢測(cè)顯示兩種細(xì)胞在藥物作用72 h后周期都阻滯于G0/G1期，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1均受到抑制。
　　2.紫草素能夠誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的衰老
　　紫草素作用肺癌細(xì)胞72 h后，SA-β-ga

9、l陽性染色細(xì)胞數(shù)增多，表明其能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生衰老樣變化，并且細(xì)胞的衰老程度與給藥濃度成正比。與此同時(shí)，也可以檢測(cè)到與衰老相關(guān)的另外一些標(biāo)志物:衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集(SAHF)出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)體積變大，變扁平。
　　3.紫草素誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致DNA損傷并通過下游信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞衰老
　　紫草素作用于A549和H1299細(xì)胞后能夠引起胞內(nèi)ROS的水平升高，進(jìn)而上調(diào)p-H2A.X、p53、p21waf蛋白的表達(dá)。同時(shí)，K

10、dm2b受到抑制，H3K36me2表達(dá)升高?？寡趸瘎㎞AC能夠抑制ROS的產(chǎn)生，逆轉(zhuǎn)紫草素對(duì)細(xì)胞活力、衰老、DNA損傷和p53蛋白的影響。
　　4.紫草素誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞中能夠檢測(cè)到細(xì)胞凋亡
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，紫草素處理三天后可以抑制細(xì)胞的自噬。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法檢測(cè)給藥后衰老組細(xì)胞的陽性染色比例升高，這表明衰老的細(xì)胞最終可能發(fā)生了凋亡。Western blot檢

11、測(cè)了與凋亡相關(guān)的蛋白，結(jié)果顯示促凋亡蛋白Bax和非線粒體途徑凋亡蛋白Cleaved Caspase-3的表達(dá)升高，同時(shí)，與Bax作用相反的凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。
　　5.紫草素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老而在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤活性
　　在建立裸鼠移植瘤的模型中，紫草素能夠抑制體內(nèi)腫瘤的生長。在持續(xù)4周的灌胃給藥過程中，各給藥組小鼠體重?zé)o明顯波動(dòng)，但與空白溶劑處理組相比，給藥組腫瘤的生長明顯受到抑制。紫草素5 mg/kg和10 mg

12、/kg給藥組的腫瘤抑制率分別達(dá)到28.57％、55.84％。隨后冰凍切片檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性結(jié)果顯示，給藥組衰老細(xì)胞明顯增多，并成濃度依耐性。免疫組化結(jié)果顯示，給藥后DNA損傷蛋白p-H2A.X表達(dá)增多，同時(shí)p53也增多，相反的是自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)減少。
　　結(jié)論:
　　在體外實(shí)驗(yàn)中，紫草素能夠誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致DNA損傷，通過p53/p21 waf信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞衰老。在A549裸鼠移植瘤模型中