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文檔簡(jiǎn)介
1、新城疫作為危害全球養(yǎng)禽業(yè)的烈性傳染病之一,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)劃定為A類(lèi)傳染病。隨著NDV變異毒株的不斷出現(xiàn),非典型性新城疫不斷增多,雞只免疫帶毒現(xiàn)象普遍存在,因而大大限制了傳統(tǒng)疫苗的使用。而DNA疫苗為新型新城疫疫苗的研制提供了新的思路,融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)基因作為新城疫病毒的主要保護(hù)性抗原基因,成為新城疫DNA疫苗的研究熱點(diǎn)。
目前雞白痢沙門(mén)菌仍是危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的主要致病菌之一,傳統(tǒng)的藥物
2、治療極易造成細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。沙門(mén)菌經(jīng)基因工程減毒后,毒力顯著降低,但仍具有良好的侵襲力和免疫原性,可為該病的防控提供一定的思路。減毒沙門(mén)菌可通過(guò)自然感染途徑將真核質(zhì)粒DNA攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá),從而能夠有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,作為疫苗活載體具有廣闊的應(yīng)用前景。
因此,本研究構(gòu)建了減毒雞白痢沙門(mén)菌平衡致死真核遞呈系統(tǒng)及攜帶NDV HN/F基因的重組減毒雞白痢沙門(mén)菌株,進(jìn)一步研究了其生物學(xué)及免疫
3、學(xué)特性。
1.重組減毒雞白痢沙門(mén)菌平衡致死真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其特性
本試驗(yàn)以質(zhì)粒pcDNA3.1-Zeo(+)為骨架,將氨芐抗性基因Amp替換為SD-asd基因,成功構(gòu)建無(wú)抗性基因的真核互補(bǔ)質(zhì)粒pcD-asd;然后將質(zhì)粒pcD-asd電轉(zhuǎn)入減毒沙門(mén)菌ΔcrpΔasdC79-13中,成功構(gòu)建平衡致死真核遞呈系統(tǒng)ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd);進(jìn)一步將egfp報(bào)告基因克隆入真核互補(bǔ)質(zhì)粒pcD-asd的C
4、MV啟動(dòng)子下游,成功構(gòu)建重組菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd-egfp),研究該遞呈系統(tǒng)的生物學(xué)特性及其遞呈外源抗原的能力。生物學(xué)特性鑒定結(jié)果表明,重組菌株血清型與親本株ΔcrpΔasdC79-13及野生株C79-13保持一致;其生化特性與親本株基本相似,但與野毒株相比發(fā)生明顯變化;生長(zhǎng)速度較為緩慢,具有較好的體外穩(wěn)定性;重組菌株的毒力較野生株C79-13降低了約104倍;重組菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-a
5、sd-egfp)感染CEF細(xì)胞后,Western Blot結(jié)果表明成功表達(dá)了約為27 kDa的EGFP蛋白。上述結(jié)果表明,成功構(gòu)建了重組減毒雞白痢沙門(mén)菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死真核遞呈系統(tǒng)。
2.攜帶NDV HN/F基因的重組減毒雞白痢沙門(mén)菌構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
本試驗(yàn)將RT-PCR擴(kuò)增出的HN/F基因片段插入至無(wú)抗性真核互補(bǔ)質(zhì)粒pcD-asd的CMV啟動(dòng)子下游,分別成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒
6、pcD-asd-HN和pcD-asd-F(即pcD-asd-HN/F),然后將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入?crp?asdC79-13中,成功構(gòu)建了重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F),并進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性及其遞呈HN/F蛋白的能力。試驗(yàn)結(jié)果表明,該重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)的生化特性及生長(zhǎng)特性與?crp?asdC79-13基本保持一致;重組菌株能夠在體內(nèi)體外穩(wěn)定攜帶HN/F基因
7、;重組菌株的毒力較野生株C79-13降低了約104倍;重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)感染CEF細(xì)胞后,可分別表達(dá)約為63和60 KDa的HN和F蛋白。上述結(jié)果表明,成功構(gòu)建了重組NDV HN/F基因減毒雞白痢沙門(mén)菌,且能有效遞呈NDV HN/F在CEF細(xì)胞中的表達(dá)。
3.攜帶NDV HN/F基因的重組減毒雞白痢沙門(mén)菌免疫學(xué)試特性研究
雛雞口服免疫重組菌株,研究其免疫學(xué)特性。結(jié)果表明,
8、重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)能夠顯著刺激雞體免疫器官的生長(zhǎng)和發(fā)育(P<0.05),但對(duì)雞只體重的影響無(wú)顯著性差異(P>0.05);NDV抗體水平在免疫后不斷增高,3 w達(dá)到峰值,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),重組菌株 HN組的抗體水平較重組菌株 F組高,但組間沒(méi)有差異;沙門(mén)菌 IgG抗體水平在免疫后不斷增高,3 w達(dá)到峰值,顯著高于對(duì)照組(P<0.05);雞消化道sIgA抗體水平在免疫后不斷增高,3
9、 w達(dá)到峰值,顯著高于對(duì)照組(P<0.05),重組菌株 HN組的抗體水平較重組菌株 F組高,但組間沒(méi)有差異;淋巴細(xì)胞的增殖水平在免疫后緩慢增高,3 w達(dá)到峰值,顯著高于對(duì)照組(P<0.05);IFN-γ水平在免疫后不斷增高,4 w達(dá)到峰值,顯著高于對(duì)照組(P<0.05);重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)對(duì)沙門(mén)菌強(qiáng)毒株 C79-13的攻毒保護(hù)率為100%,對(duì) NDV強(qiáng)毒株 F48E8的攻毒保護(hù)率分別為70%
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