NK細胞的程序性擴增及功能鑒定.pdf

1、自然殺傷細胞(NK細胞)是固有免疫系統(tǒng)中的一種重要細胞，在抗病毒、抗腫瘤過程中發(fā)揮著重要作用。在造血干細胞移植過程中，NK細胞是最早出現(xiàn)的免疫細胞，發(fā)揮著重要的抗白血病細胞效應，而且不會引發(fā)機體移植物抗宿主病。因此，NK細胞在白血病過繼轉(zhuǎn)輸治療方面具有重要的應用前景。體外擴增大量功能性NK細胞并獲得有效的治療效果是目前NK細胞臨床應用研究的熱點。就這些問題，我們進行了相關(guān)的實驗，得到以下結(jié)果:
　　1、通過采用臍血CD34+干細胞

2、，應用不同的細胞因子組合使其最終分化為NK細胞。經(jīng)過五周的培養(yǎng)，NK細胞的比例可達到90％以上，擴增約7000倍。通過對不同階段培養(yǎng)細胞差異表達的基因進行聚類及相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)前三周細胞和后兩周細胞之間的基因表達有明顯不同，根據(jù)這一現(xiàn)象，我們將NK細胞的體外分化過程分別命名為程序一和程序二。
　　2、對已報道的轉(zhuǎn)錄因子進行檢測，發(fā)現(xiàn)程序二的細胞與原代NK細胞具有相似的轉(zhuǎn)錄因子表達譜，表明所培養(yǎng)的細胞可以作為研究NK細胞發(fā)育分化

3、的體外模型。進而對兩個分化階段的細胞進行差異表達的轉(zhuǎn)錄因子分析，我們發(fā)現(xiàn)程序一的細胞主要聚集鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，而程序二的細胞主要聚集基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)域家族和螺旋-轉(zhuǎn)向-螺旋結(jié)構(gòu)域家族的轉(zhuǎn)錄因子。對相應的轉(zhuǎn)錄因子進行分析，表明程序一為NK細胞前體，程序二調(diào)控NK細胞的轉(zhuǎn)化以及功能成熟。
　　3、對不同階段培養(yǎng)細胞的趨化因子受體及細胞因子受體表達譜進行分析，我們發(fā)現(xiàn)程序二，即分化的NK細胞表達相對高水平的NK細胞功能相關(guān)受體，表明此細胞具

4、有發(fā)揮相應NK細胞活化及殺傷功能的潛能。
　　4、隨后我們對不同階段細胞殺傷性分子的表達進行分析檢測，同樣發(fā)現(xiàn)分化的NK細胞表達更高水平的炎性細胞因子及殺傷相關(guān)的功能分子，并且該細胞具有較強的細胞殺傷活性。
　　5、對所做的芯片進行深層次的挖掘，我們發(fā)現(xiàn)分化的NK細胞表達大量的SLAM家族的受體，包括CD244、CD48、CRACC和NTBA。具有較強殺傷功能的外周血NK及臍帶血NK細胞高表達以上的SLAM家族受體。并且，培

5、養(yǎng)的細胞表達有SAP和EAT-2，確保SLAM家族受體可以傳遞活化性信號。
　　6、通過RT-PCR和流式細胞術(shù)進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)血液系統(tǒng)腫瘤細胞系相較于實體瘤細胞系，表達更高水平的SLAM家族對應配體，CD48、CD244、CRACC和NTBA。同樣的，臨床白血病病人的白血病細胞也有相應配體的表達，提示NK細胞可通過SLAM家族受配體的相互作用更有效殺傷白血病細胞。
　　7、應用過表達或干擾SLAM家族配體的細胞進行細胞結(jié)

6、合和殺傷實驗，我們發(fā)現(xiàn)SLAM家族受配體的相互作用可以促進NK細胞與靶細胞的結(jié)合及促進其對靶細胞的殺傷。對臨床白血病病人SLAM家族配體的表達水平與NK細胞的殺傷能力進行檢測，發(fā)現(xiàn)白血病細胞上SLAM家族配體表達水平越高，NK細胞的殺傷能力越強。
　　結(jié)合上述的實驗結(jié)果，我們建立了一個體外大規(guī)模分化擴增NK細胞的體系，并且發(fā)現(xiàn)在NK細胞的發(fā)育分化過程中，無論在轉(zhuǎn)錄因子、細胞受體及功能方面都有明顯的分區(qū)，存在一種程序性的分化模式。對