賴氨酸羥化酶PLOD2在乏氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤遷移與侵襲過程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM，WHOⅣ級)是人類中樞系統(tǒng)最常見、惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤。目前，即便在顯微神經(jīng)外科手術(shù)和藥物治療方面取得長足發(fā)展，但總體療效收效甚微，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的平均中位生存期僅為14個月。腫瘤細(xì)胞向周圍腦實(shí)質(zhì)呈浸潤侵襲性生長是手術(shù)很難將其完全切除的主要原因，同時，目前也認(rèn)為這種侵襲特性是對多種綜合治療方案產(chǎn)生抵抗的主要因素之一。然而，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲

2、相關(guān)分子機(jī)制至今尚未闡釋清晰，因此，進(jìn)一步完善侵襲相關(guān)機(jī)制的研究，對改善腫瘤治療及患者預(yù)后都將有非常重要的臨床意義。
　　為了更深入地了解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲相關(guān)機(jī)制，除了研究腫瘤細(xì)胞自身的特性外，還需要關(guān)注獨(dú)特而又復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。乏氧是腫瘤微環(huán)境的顯著特征之一，近年來受到越來越多的關(guān)注。目前認(rèn)為乏氧與腫瘤的增殖、發(fā)生發(fā)展以及傳統(tǒng)治療的抵抗密切相關(guān)。乏氧可以阻止乏氧誘導(dǎo)因子-1α/2α(Hypoxia-inducible fact

3、or-1/2α，HiF-1/2α)的降解，病理狀態(tài)下HiF-1/2α可同持續(xù)激活的亞單位HiF-1β形成二聚體，特異性結(jié)合到基因上游乏氧調(diào)控元件上，激活相關(guān)基因的表達(dá)。因此，探究乏氧如何調(diào)節(jié)特定蛋白參與腫瘤侵襲的相關(guān)機(jī)制將有助于新的腫瘤治療策略的研發(fā)。
　　細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)重塑是腫瘤微環(huán)境的又一典型特征。在腫瘤進(jìn)展過程中，瘤周常常出現(xiàn)大量的膠原蛋白沉積與交聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)硬度增加

4、。目前已證實(shí)，它可以促進(jìn)腫瘤的浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。已有的報道指出，包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種實(shí)體瘤的細(xì)胞外基質(zhì)均存在硬度增加的改變。另外，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分——膠原纖維也與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管生成以及細(xì)胞黏附密切相關(guān)。膠原纖維交聯(lián)的形成需要賴氨酸羥化酶2(Procollagen-Lysine2-Oxoglutarate5-Dioxygenase2，PLOD2)的翻譯后修飾。依據(jù)功能不同，賴氨酸羥化酶可以分為三種不同的亞型——PLOD1、PLOD2

5、、PLOD3。賴氨酸羥化酶PLOD1特異性結(jié)合到膠原纖維α螺旋及中央?yún)^(qū)域，羥化修飾該區(qū)域的賴氨酸殘基，PLOD2特異性羥化端肽區(qū)域中的賴氨酸殘基，而PLOD3的催化底物尚不清楚。但在膠原交聯(lián)形成過程中，尤以端肽區(qū)域內(nèi)的羥基化賴氨酸最為重要。在纖維性疾病中，膠原纖維的過度沉積主要是由于端肽的過度羥化及羥化賴氨酸殘基形成的吡啶啉交聯(lián)數(shù)目增加引起的。這種吡啶啉交聯(lián)物理性質(zhì)更加穩(wěn)定，難以降解，而PLOD2是形成這種交聯(lián)的關(guān)鍵催化酶。目前，PLO

6、D2相關(guān)作用的研究在某些纖維性疾病如Bruck Syndrome、Ehlers-Danlos Syndrome VIA中已經(jīng)報道。但PLOD2在膠質(zhì)瘤中的作用尚不明確，目前僅有組織學(xué)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，賴氨酸羥化酶PLOD2可以作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一個新型生物學(xué)標(biāo)志物。
　　本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上，通過借助公共數(shù)據(jù)庫大數(shù)據(jù)分析、臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本收集以及免疫組化、天狼星紅染色、ELISA、慢病毒感染、RNA干擾、裸鼠原位腫瘤種植等相關(guān)分子生

7、物學(xué)技術(shù)，分別從患者病理資料信息及分子生物水平探討賴氨酸羥化酶PLOD2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分賴氨酸羥化酶PLOD2在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況
　　目的:
　　明確賴氨酸羥化酶PLOD2在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。
　　方法:
　　1.借助公共數(shù)據(jù)庫Oncomine Database薈萃分析不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者PLOD2mRNA表達(dá)水平
　　2.借助公共數(shù)據(jù)庫REMB

8、RANDT Database分析PLOD2 mRNA在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異情況
　　3.免疫組織化學(xué)染色檢測不同級別膠質(zhì)瘤患者PLOD2蛋白表達(dá)程度
　　4.借助TCGA數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier法繪制基因PLOD2不同表達(dá)程度患者的生存曲線
　　結(jié)果:
　　1.PLOD2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并呈現(xiàn)病理級別依賴性特征
　　借助公共數(shù)據(jù)庫Oncomine Database廣泛性地檢索患者病理組織基因芯片

9、測序結(jié)果，薈萃分析(Meta-analysis)了7個獨(dú)立膠質(zhì)母細(xì)胞瘤數(shù)據(jù)庫，包含876例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同正常腦組織相比，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者PLOD2mRNA轉(zhuǎn)錄水平一致性地高表達(dá)（Mean DifferenceⅣ Random:1.71;95％CI:1.23-2.19;P＜0.001）。此外，選用數(shù)據(jù)庫REMBRANDT Database，入選病例178例，分析PLOD2在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)程度。結(jié)果證實(shí)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

10、組織中的PLOD2 mRNA表達(dá)水平顯著性高于正常腦組織、Ⅰ、Ⅱ級膠質(zhì)瘤(＞3倍，P＜0.0001)。免疫組織化學(xué)染色方法檢測PLOD2在9例正常腦組織、20例Ⅱ級、20例Ⅲ級、29例Ⅳ膠質(zhì)瘤（膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）中的表達(dá)情況。在正常腦組織和Ⅱ級膠質(zhì)瘤中，PLOD2的免疫染色呈陰性或弱陽性;但隨著腫瘤級別的升高，染色強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，在Ⅳ級膠質(zhì)瘤中PLOD2呈強(qiáng)陽性，而在正常腦組織和Ⅱ級膠質(zhì)瘤之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，在上述結(jié)果基礎(chǔ)上，匯總TCG

11、A以及REMBRANDT Database中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及非膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者PLOD2mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，選用ROC曲線模型(Receiver Operating Characteristic Curve)分析PLOD2在疑診膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的診斷價值。ROC曲線計(jì)算曲線下面積為0.785(95％CI，0.785-0.828)，提示PLOD2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤鑒別診斷中具有較好的效度。
　　2.PLOD2表達(dá)水平與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后呈

12、負(fù)相關(guān)
　　借助TCGA數(shù)據(jù)庫，剔除臨床信息不全病例，分別納入病例522例(OS)及386例(PFS)，采用Kaplan-Meier法繪制PLOD2低表達(dá)和PLOD2高表達(dá)患者的生存曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)組患者中位總生存期(OS)為14.95個月(95％CI，9.484-20.052個月)，而高表達(dá)組的中位OS為13.93個月(95％ CI，12.884-15.020個月);低表達(dá)組的中位無進(jìn)展生存期(PFS)為10.22個月(9

13、5％ CI，6.03-14.41個月)，而高表達(dá)組的中位PFS為7個月（95％CI，6.141-7.859個月）。使用Log-rank test統(tǒng)計(jì)分析:低表達(dá)組和高表達(dá)組的OS和PFS之間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OS，P＜0.05; PFS，P＜0.0005）。
　　結(jié)論:
　　1.PLOD2在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并與腫瘤級別呈正相關(guān)性;
　　2.PLOD2表達(dá)程度與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分乏氧調(diào)控

14、膠質(zhì)瘤賴氨酸羥化酶PLOD2的表達(dá)
　　目的:
　　探究乏氧調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞賴氨酸羥化酶PLOD2的表達(dá)機(jī)制
　　方法:
　　1.Western blot檢測乏氧處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中PLOD2表達(dá)水平
　　2.Western blot檢測敲除內(nèi)源性HiF-1α或HiF-2α或加入HiF-1α抑制劑后乏氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251 PLOD2的表達(dá)情況
　　3.PLOD2轉(zhuǎn)錄水平同H

15、iF-1α轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)分析
　　結(jié)果:
　　乏氧通過乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HiF-1α)誘導(dǎo)PLOD2的表達(dá)
　　在細(xì)胞U87與U251中，為了驗(yàn)證乏氧能否誘導(dǎo)PLOD2的表達(dá)，收集乏氧處理48 h的細(xì)胞，分別從mRNA和蛋白水平檢測PLOD2表達(dá)程度，同時裂解乏氧不同持續(xù)時間(0，6h，12h，24h，48h)處理后的細(xì)胞并進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示，乏氧可以誘導(dǎo)U87和U251中PLOD2的表達(dá)。同

16、常氧組相比，乏氧處理后的腫瘤細(xì)胞PLOD2表達(dá)水平被顯著性提高2～3倍且呈時間依賴性。采用siRNA敲除實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究乏氧是通過HiF-1α還是HiF-2α來轉(zhuǎn)錄調(diào)控PLOD2的表達(dá)的。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)敲除U87與U251中內(nèi)源性HiF-1α后可以抑制乏氧誘導(dǎo)的PLOD2的表達(dá);但是敲除內(nèi)源性HiF-2α并未抑制PLOD2的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，將HiF-1α特異性抑制劑PX-478加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，結(jié)果再次證

17、實(shí)乏氧通過HiF-1α誘導(dǎo)PLOD2的表達(dá)。此外，TCGA數(shù)據(jù)庫大數(shù)據(jù)相關(guān)分析結(jié)果同樣支持上述結(jié)果:在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，PLOD2mRNA轉(zhuǎn)錄水平同HiF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)(r2=0.215，P＜0.0001)。
　　結(jié)論:
　　乏氧通過HiF-1α調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PLOD2的表達(dá)
　　第三部分賴氨酸羥化酶PLOD2在乏氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤遷移與侵襲中的作用及機(jī)制
　　目的:
　　明確賴氨酸羥化酶P

18、LOD2在乏氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤遷移與侵襲中的作用及相關(guān)機(jī)制
　　方法:
　　1.CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)/平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測敲除PLOD2后膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251增殖能力變化
　　2.ELISA檢測乏氧處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251上清中Ⅰ型膠原纖維含量變化情況
　　3.Transwell小室遷移模型檢測敲除PLOD2后乏氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251遷移能力變化
　　4.3D侵襲模型檢測敲除PLOD2后

19、乏氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251侵襲能力變化
　　5.高分辨激光共聚焦顯微鏡觀察敲除PLOD2后乏氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251形態(tài)改變情況
　　6.動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲除PLOD2后膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251顱內(nèi)侵襲能力變化
　　結(jié)果:
　　1.敲除PLOD2不影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力及膠原纖維合成
　　為了研究PLOD2是否調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展，我們首先構(gòu)建了特異性敲除PLOD2慢病毒載體shPLO

20、D2及陰對照慢病毒載體shNC。為了檢驗(yàn)敲除PLOD2后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力及膠原合成能力的變化情況，我們選用上述慢病毒載體構(gòu)建了穩(wěn)定敲除PLOD2的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251。CCK8細(xì)胞生長曲線顯示，敲除PLOD2未改變腫瘤細(xì)胞的增殖能力，同時，細(xì)胞克隆形成能力也未受影響。對于PLOD2敲除后腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中Ⅰ型膠原蛋白含量的變化情況，我們選用人源Collagen I ELISA試劑盒檢測。結(jié)果證實(shí)，乏氧本身可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ⅰ型

21、膠原纖維的合成與分泌，但敲除PLOD2后未影響該過程。
　　2.敲除PLOD2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移與侵襲
　　分別將穩(wěn)定敲除PLOD2(shPLOD2)和陰性對照(shNC)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251接種到遷移模型Transwell小室的上室，下室添加含20％FBS的完全培養(yǎng)基，然后將模型置于常氧或乏氧下12h。結(jié)果顯示，雖然乏氧促進(jìn)U87和U251的遷移（～1.5倍，P＜0.001），但是敲除PLOD2后，腫瘤細(xì)胞遷移能力

22、顯著下降（＞30％，P＜0.001）。3D侵襲模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乏氧條件下，U87與U251細(xì)胞均增殖為結(jié)構(gòu)良好的瘤球體，并且向周圍基質(zhì)最大程度的放射狀侵襲，敲除PLOD2后，腫瘤細(xì)胞侵襲基質(zhì)膠能力明顯下降，尤其是在乏氧條件下。
　　3.PLOD2通過FAK信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移與侵襲
　　一方面，腫瘤細(xì)胞通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs協(xié)助自身侵襲，而我們Western blot的檢測結(jié)果證實(shí)，在常氧和乏氧環(huán)境下腫瘤

23、細(xì)胞U87和U251MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平在敲除PLOD2前后未受影響。另一方面，腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲過程中往往伴隨細(xì)胞形態(tài)、骨架及黏著斑的變化。高分辨激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)乏氧可以顯著性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表面黏著斑的形成，表現(xiàn)為樁蛋白(Paxillin;綠色)與肌動蛋白纖維(Phalloidin;紅色)在黏著斑上共定位的增加。在常氧和乏氧狀態(tài)下，敲除PLOD2后黏著斑形成數(shù)目降低，肌動蛋白纖維排列雜亂。目前認(rèn)為調(diào)控細(xì)胞形態(tài)及黏著斑

24、形成的關(guān)鍵蛋白是黏著斑激酶(Focal adhesionkinase，F(xiàn)AK)。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果，我們推測FAK可能是PLOD2的下游靶分子。Western blot檢測檢測發(fā)現(xiàn)在常氧或乏氧環(huán)境下，敲除PLOD2可顯著性降低腫瘤細(xì)胞U87和U251中FAK磷酸化水平(FAK-p397)。為進(jìn)一步明確結(jié)果，我們使用FAK特異性抑制劑TAE226處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞，數(shù)據(jù)顯示在乏氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PLOD2的同時，F(xiàn)AK抑制劑TAE226可以抑制

25、FAK磷酸化水平(FAK-p397)。而且，在常氧及乏氧環(huán)境下，加入TAE226后腫瘤細(xì)胞的遷移與3D侵襲均受到抑制。
　　4.動物實(shí)驗(yàn):PLOD2可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲
　　分別選用皮下成瘤及顱內(nèi)原位種植腫瘤裸鼠模型加以驗(yàn)證，在皮下成瘤模型實(shí)驗(yàn)中，U251-shPLOD2組與U251-shNC組相比，腫瘤體積無明顯差別。ELISA試劑盒檢測瘤體內(nèi)羥脯氨酸含量，間接反映瘤體內(nèi)Ⅰ型膠原纖維含量，結(jié)果證實(shí)兩組間無明顯差別。瘤體硬

26、度測定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與U251-shN組相比，U251-shPLOD2組瘤體硬度明顯降低(P＜0.05）。在顱內(nèi)原位種植膠質(zhì)瘤模型中，U251-shNC組瘤體不規(guī)則，腫瘤細(xì)胞局部浸潤明顯，而U251-shPLOD2組瘤體呈現(xiàn)局限性，邊界清晰。天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)，U251-shNC組瘤體內(nèi)膠原纖維排布交錯密集，分布于腫瘤細(xì)胞周圍，而在U251-shPLOD2組中膠原纖維分布散在，較少形成交聯(lián)。
　　結(jié)論:
　　1.PLOD2通過FA