基于代謝組學(xué)方法的垂體泌乳素腺瘤藥物溴隱亭的耐藥性研究.pdf

1、溴隱亭(Bromocriptine，BC)耐藥是垂體泌乳素腺瘤藥物治療無(wú)效或復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，探索垂體泌乳素腺瘤對(duì)藥物BC產(chǎn)生耐藥性的原因并對(duì)耐藥垂體泌乳素腺瘤患者進(jìn)行準(zhǔn)確診斷有利于實(shí)施個(gè)體化治療，提高治療效果。本論文首先采用高效液相色譜(HPLC)與串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)聯(lián)用技術(shù)，建立了靈敏、快速的適用于臨床垂體泌乳素腺瘤患者的血漿和腫瘤組織中藥物BC的定量分析方法。采用該方法比較分析了耐藥型與敏感型垂體泌乳素腺瘤患者的血漿及腫瘤組織中

2、藥物BC的分布差異，發(fā)現(xiàn)藥物BC在耐藥患者體內(nèi)也能夠被有效地吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤組織，在腫瘤組織中維持較高的含量，耐藥型垂體泌乳素腺瘤患者經(jīng)BC治療無(wú)效的原因可能是腫瘤細(xì)胞自身對(duì)藥物產(chǎn)生的耐藥性。在上述研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用基于LC-MS/MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法，分別以臨床垂體泌乳素腺瘤患者的血漿和大鼠垂體泌乳素腺瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，開(kāi)展了垂體泌乳素腺瘤藥物BC的耐藥性研究。篩選出一批與耐藥相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，并利用發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物進(jìn)行了代

3、謝通路分析，在BC耐藥垂體泌乳素腺瘤患者和耐藥腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了與耐藥相關(guān)的發(fā)生紊亂的代謝通路。本研究結(jié)果為臨床BC耐藥垂體泌乳素腺瘤的耐藥性機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)及重要依據(jù)。
　　本論文的研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)部分:
　　1.臨床患者血漿及垂體泌乳素腺瘤組織中藥物溴隱亭的定量分析
　　采用LC-MS/MS技術(shù)，通過(guò)對(duì)色譜條件和MRM檢測(cè)模式下質(zhì)譜參數(shù)的系統(tǒng)優(yōu)化，建立了靈敏、快速、專屬性強(qiáng)，適用于臨床人體血漿和腫瘤組織中藥

4、物BC的定量分析方法。采用該方法對(duì)耐藥型和敏感型垂體泌乳素腺瘤患者的血漿及腫瘤組織中藥物BC進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)耐藥患者口服BC2，4和6h后，體內(nèi)血漿藥物濃度明顯高于敏感患者;服藥3個(gè)月后的耐藥患者腫瘤組織中的BC濃度也明顯高于敏感患者，表明BC在耐藥患者體內(nèi)也能夠被有效地吸收，并能夠被有效地從血漿轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤組織，在腫瘤組織中維持較高的藥物含量。本研究顯示腫瘤細(xì)胞自身對(duì)藥物BC產(chǎn)生的抵抗可能是導(dǎo)致耐藥型垂體泌乳素腺瘤患者經(jīng)藥物BC治療

5、無(wú)效的原因。
　　2.溴隱亭耐藥垂體泌乳素腺瘤的血漿代謝組學(xué)研究
　　采用正、負(fù)離子檢測(cè)模式相結(jié)合的LC-MS/MS分析方法，對(duì)BC耐藥型和敏感型垂體泌乳素腺瘤患者的血漿樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。最終在耐藥患者和敏感患者的血漿中發(fā)現(xiàn)了64個(gè)具有顯著性差異的代謝物，即潛在耐藥標(biāo)志物。進(jìn)一步通過(guò)高分辨率MS譜及MS/MS譜分析，結(jié)合同位素豐度比、氮規(guī)則，以及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比等分析手段與步驟對(duì)這些潛在耐藥標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了

6、分析鑒定。目前，共鑒定出21個(gè)潛在耐藥標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)，包括氨基酸、鞘脂、脂肪酸類等代謝物，其中1-磷酸二氫鞘氨醇、C16鞘氨醇、1-脫氧C14二氫鞘氨醇等9個(gè)潛在耐藥標(biāo)志物具有較高的診斷準(zhǔn)確性(AUC＞0.9)。進(jìn)一步對(duì)這些潛在耐藥標(biāo)志物進(jìn)行了代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)與BC敏感型垂體泌乳素腺瘤患者相比，耐藥患者體內(nèi)鞘脂類代謝，賴氨酸生物合成，氨酰tRNA生物合成，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，賴氨酸降解等多條代謝通路發(fā)生紊亂。
　　3.

7、溴隱亭耐藥垂體泌乳素腺瘤的細(xì)胞代謝組學(xué)研究
　　以大鼠垂體泌乳素腺瘤耐藥型GH3細(xì)胞及敏感型MMQ細(xì)胞為研究對(duì)象，開(kāi)展了藥物BC耐藥垂體泌乳素腺瘤的細(xì)胞代謝組學(xué)研究。首先，在細(xì)胞樣品前處理的過(guò)程中，采用液氮冷凍法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行淬滅，并分別采用甲醇、甲醇、水對(duì)絀胞樣品進(jìn)行3次提取。在此基礎(chǔ)上，對(duì)細(xì)胞數(shù)目和復(fù)溶溶劑進(jìn)行了考察，最終確定細(xì)胞樣品中的細(xì)胞數(shù)目應(yīng)≥5×106個(gè)，以80％甲醇水作為復(fù)溶溶劑，優(yōu)化了垂體泌乳素腺瘤細(xì)胞的代謝組學(xué)樣品前

8、處理方法。其次，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)對(duì)藥物BC作用不同時(shí)間后MMQ和GH3細(xì)胞培養(yǎng)基中的泌乳素(Prolactin，PRL)進(jìn)行了檢測(cè)，考察了耐藥型GH3細(xì)胞經(jīng)BC作用后PRL水平的變化，并比較分析了藥物BC對(duì)兩種細(xì)胞PRL分泌的抑制效果，為潛在耐藥標(biāo)志物的篩選提供了依據(jù)。進(jìn)一步采用與血漿代謝組學(xué)相同的分析方法，對(duì)未經(jīng)藥物BC作用的MMQ和GH3細(xì)胞開(kāi)展了代

9、謝組學(xué)分析，通過(guò)多變量統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)了60個(gè)與耐藥相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，并鑒定出24個(gè)潛在耐藥標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)，其中包括膽堿、氨基酸、肉堿、核苷類等代謝物。代謝通路分析表明，與BC敏感型垂體泌乳素腺瘤細(xì)胞相比，耐藥腫瘤細(xì)胞中甘油磷脂代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，磷酸肌醇代謝，谷胱甘肽代謝等多條代謝通路發(fā)生紊亂。其中，甘油磷脂代謝，泛酸酯和輔酶A生物合成，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，氨酰tRNA生物