溴區(qū)包含蛋白7在糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　糖尿病性心肌病(DCM)是一種糖尿病引起的，與冠狀動(dòng)脈疾病、心臟瓣膜病和高血壓無(wú)關(guān)的心臟疾病。DCM是導(dǎo)致糖尿病相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要原因。過(guò)去十年中對(duì)DCM的發(fā)病機(jī)制研究較多，主要包括受損的鈣穩(wěn)態(tài)、胰島素抵抗、脂質(zhì)攝取的增加、葡萄糖毒性、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS系統(tǒng))激活和氧化應(yīng)激。上述機(jī)制均可引起糖尿病患者廣泛的心肌結(jié)構(gòu)異常，如心肌間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞肥大和凋亡，并且最終導(dǎo)致左心室肥大和舒張和/

2、或收縮功能障礙。其中，心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病性心肌病發(fā)展過(guò)程中的主要事件。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，早期即可觀察到心肌細(xì)胞凋亡的顯著增加。由于成人心肌細(xì)胞很少增殖，因此心肌細(xì)胞的丟失最終將導(dǎo)致心功能受損。因此，抑制心肌凋亡是預(yù)防DCM的重要策略。有研究報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變非常敏感，在DCM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要的作用。然而，糖尿病誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍不明確。
　　溴區(qū)包含蛋

3、白7(BRD7)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的蛋白。在人體組織中普遍表達(dá)，包括腦、心臟、肺、結(jié)腸和乳腺。它是溴區(qū)包含蛋白家族成員之一，并且作為重要的腫瘤抑制因子廣泛參與細(xì)胞的各種生物學(xué)活動(dòng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。近年來(lái)越來(lái)越多的研究報(bào)道BRD7在細(xì)胞凋亡始動(dòng)環(huán)節(jié)的作用。最近一項(xiàng)研究表明，在肥胖小鼠的肝臟中BRD7通過(guò)調(diào)節(jié)XBP-1s核轉(zhuǎn)位調(diào)控ERS信號(hào)通路。目前BRD7的研究多集中在腫瘤疾病中，對(duì)于DCM心肌組織中BRD7

4、的表達(dá)及作用尚未見報(bào)道。本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型為研究對(duì)象，探討B(tài)RD7在DCM心肌組織中的表達(dá)及其對(duì)DCM的作用。
　　研究目的:
　　1.研究BRD7在DCM心肌細(xì)胞中的表達(dá)情況;
　　2.研究BRD7對(duì)DCM大鼠心室重構(gòu)及心功能異常的影響;
　　3.研究BRD7對(duì)糖尿病誘導(dǎo)的心肌間質(zhì)纖維化及心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究方法
　　1.慢病毒shRNA-BRD7載體的構(gòu)

5、建
　　設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)大鼠BRD7基因的shRNA質(zhì)粒，應(yīng)用蛋白免疫印跡法分析每個(gè)質(zhì)粒的干擾效率，選擇其中效率最高的質(zhì)粒，構(gòu)建成含有綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因的慢病毒載體。針對(duì)BRD7的干擾序列為5'-GGACTCTGGAGATGC-TGAA-3'，空載體序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。
　　2.1型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建及shRNA-BRD7慢病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染
　　將60只健康雄性Wistar大

6、鼠（平均體重200±20g）適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為四組（每組15只）:正常對(duì)照組（NC組）、糖尿病組（DM組）、糖尿病+慢病毒空載體組（DM+shRNA-N.C組）及糖尿病+BRD7基因沉默組（DM+shRNA-BRD7組）。三組糖尿病大鼠分別給與一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，劑量為60mg/kg。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5)。STZ注射后1周，取大鼠尾靜脈血測(cè)量空腹血

7、糖，連續(xù)2次空腹血糖≥16.7 mmol/L認(rèn)為1型糖尿病造模成功。STZ注射后12周，DM+shRNA-BRD7組大鼠頸靜脈注射1×108 UT/50μl的shRNA-BRD7慢病毒載體，DM+shRNA-N.C組大鼠頸靜脈注射同等劑量的慢病毒空載體。病毒轉(zhuǎn)染4周后，對(duì)所有大鼠實(shí)施安樂(lè)死，留取血液及左室組織用于組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)。
　　3.各組實(shí)驗(yàn)大鼠基本指標(biāo)的測(cè)量
　　血糖的檢測(cè):實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，四組大鼠分別于STZ注射

8、前（0周）、STZ注射后1周、12周、16周取尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖水平。
　　血壓和心率的檢測(cè):于實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，檢測(cè)各組大鼠的心率(HR)、尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動(dòng)脈壓(MBP)。每只動(dòng)物測(cè)量3次后取平均值。
　　4.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別于STZ注射后12周、16周，采用M超及脈沖多普勒超聲成像技術(shù)獲取各組大鼠心功能參數(shù)，評(píng)價(jià)心功能。
　　5.組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)
　　各組大鼠

9、心臟取材后，制備石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)H&E染色以觀察心臟組織形態(tài)及心肌細(xì)胞形態(tài)情況，Masson染色及天狼星紅染色用以檢測(cè)心肌膠原含量。采用免疫組織化學(xué)染色法，檢測(cè)心肌組織內(nèi)BRD7的表達(dá)及分布情況。
　　6.TUNEL染色
　　采用TUNEL染色法檢測(cè)各組動(dòng)物左室心肌組織中心肌細(xì)胞的凋亡水平。
　　7.Western blot檢測(cè)
　　提取各組大鼠左室心肌組織蛋白，分別檢測(cè)心肌組織內(nèi)BRD7、CHOP、cleav

10、ed caspase-3、full length caspase-3、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、t-AKT、Bax、 Bcl-2和β-actin的蛋白表達(dá)水平。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本情況
　　與正常大鼠相比，糖尿病

11、組大鼠呈現(xiàn)多飲、多食、多尿及體態(tài)消瘦等癥狀。給予BRD7基因沉默治療后，DM+shRNA-BRD7組大鼠一般狀態(tài)較慢病毒空載體組稍微改善。
　　2.各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本指標(biāo)
　　實(shí)驗(yàn)初期，各組大鼠血糖無(wú)明顯差異，STZ注射后一周，三組糖尿病大鼠血糖水平明顯高于正常對(duì)照組并維持到實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢种艬RD7血糖水平較糖尿病組大鼠無(wú)明顯改善。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，各組大鼠血壓無(wú)明顯差異。DM組與正常對(duì)照組比較，體重(BW)明顯降低，心率(HR)、心

12、臟重量(HW)及心身比(HW/BW)升高;與糖尿病空載體對(duì)照組大鼠相比，抑制BRD7可降低HW和HW/BW，對(duì)體重及心率無(wú)明顯影響。
　　3.BRD7在DCM大鼠左室心肌組織中表達(dá)升高
　　與正常對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠心肌組織中的BRD7蛋白水平表達(dá)明顯升高。ShRNA-BRD7慢病毒轉(zhuǎn)染DM+shRNA-BRD7組大鼠心肌組織4周后，BRD7的蛋白表達(dá)較空載體對(duì)照組顯著降低。
　　4.抑制BRD7改善DCM大鼠的心

13、功能異常
　　糖尿病成模后12周，與正常對(duì)照組比較，三組糖尿病大鼠均呈現(xiàn)出左室舒張功能受損，主要表現(xiàn)為E/A降低;并伴有左室收縮功能障礙，表現(xiàn)為左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左室短軸縮短率(FS)降低;同時(shí)左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)、左室質(zhì)量(LV mass)及左室后壁厚度(LVPWd)均增加。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谂c正常對(duì)照組大鼠相比，糖尿病組大鼠E/A、LVEF、FS明顯降低，LVEDd、LVPWd、LV mass顯著增加。抑制B

14、RD7可明顯改善糖尿病引起的心功能障礙。
　　5.抑制BRD7明顯改善糖尿病誘導(dǎo)的心室重構(gòu)和纖維化程度
　　與正常大鼠相比，糖尿病大鼠心臟形態(tài)明顯增大，心尖部變圓潤(rùn)，心腔擴(kuò)大。鏡下觀察及分析，心肌細(xì)胞直徑明顯增寬，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂。抑制BRD7可顯著改善心臟形態(tài)及結(jié)構(gòu)的變化。Masson染色及天狼星紅染色顯示糖尿病組大鼠心肌間質(zhì)纖維化程度明顯高于正常組大鼠。與糖尿病及慢病毒空載體組相比，抑制BRD7可明顯緩解心肌間質(zhì)膠原

15、沉積。
　　6.抑制BRD7減少DCM大鼠的心肌細(xì)胞凋亡
　　Western blot和TUNEL染色結(jié)果顯示糖尿病大鼠心肌組織中cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)、Bax/Bcl-2的比值和心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加;然而，與慢病毒空載體組相比，抑制BRD7明顯降低糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。CHOP是ERS通路的特異性凋亡因子。與正常大鼠比較，糖尿病大鼠心肌組織CHOP的蛋白表達(dá)明顯升高，抑制BRD7可有效降低CHOP

16、的表達(dá)。提示BRD7介導(dǎo)DCM心肌細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路有關(guān)。
　　7.BRD7負(fù)向調(diào)控糖尿病大鼠心肌組織中AKT的活性
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠心肌組織中p-AKT(Ser473)和p-AKT(Thr308)的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，抑制BRD7后能夠明顯升高糖尿病大鼠心肌組織中AKT(Ser473)和AKT(Thr308)磷酸化水平。
　　研究結(jié)論:
　　1.1型DCM大鼠心肌