基于PI3K-Akt信號轉導通路探討麝香通心滴丸抗心肌缺血的物質基礎和作用機制.pdf

1、目的：心肌缺血發(fā)病率逐年增高，目前主要干預措施是手術和藥物治療。麝香通心滴丸治療冠心病療效確切，但其對心肌保護作用的機制仍有盲點。本課題從多角度探討麝香通心滴丸對心肌缺血PI3K/Akt信號轉導通路的影響以及其有效成分的分析，以闡明麝香通心滴丸治療心肌缺血的作用機制和物質基礎。
　　方法：⑴采用腹腔注射垂體后葉素建立SD大鼠急性心肌缺血動物模型。隨機分為空白組（0.9％生理鹽水灌胃），模型組（0.9％生理鹽水灌胃），對照組（單硝酸

2、異山梨酯4.0mg/kg·d藥液灌胃），麝香通心滴丸高劑量組（42 mg/kg·d藥液灌胃），麝香通心滴丸中劑量組（21 mg/kg·d藥液灌胃），連續(xù)給藥1周后，腹腔注射垂體后葉素，造模后檢測大鼠心電圖ST段的變化，分別取大鼠心肌和腹主動脈血液，ELISA檢測血液中LDH和CK-MB濃度的變化，光鏡觀察HE染色心肌組織病理形態(tài)學變化，TUNEL檢測心肌細胞凋亡情況，qRT-PCR和免疫組化檢測心肌組織PI3K/Akt通路活化及其下游凋

3、亡相關基因表達的影響。⑵采用Na2S2O4誘導心肌細胞建立體外心肌缺血缺氧細胞模型。MTT檢測心肌細胞的活力情況，用梯度濃度法優(yōu)化Na2S2O4誘導心肌細胞凋亡以及麝香通心滴丸干預心肌細胞凋亡模型的量效關系和時效關系。隨機分為空白組、Na2S2O4模型組、麝香通心滴丸高劑量組（50μg/ml）、麝香通心滴丸低劑量組(25μg/ml)。麝香通心滴丸組預給藥后，除空白組外，分別加入Na2S2O4干預，再正常培養(yǎng)復氧后，MTT檢測心肌細胞活力

4、，Hoechst染色和流式細胞儀檢測心肌細胞的凋亡情況，qRT-PCR及Western blot觀察心肌細胞PI3K/Akt通路活化及其下游凋亡相關基因表達的影響。⑶過LC-Q-TOF-MS和GC-MS聯(lián)用技術，摸索最佳色譜和質譜條件，對麝香通心滴丸的化學成分進行分析鑒定;MTT和梯度濃度法優(yōu)化主要化學成分干預Na2S2O4誘導心肌細胞缺血缺氧模型的有效濃度;采用高內涵細胞分析儀檢測麝香通心滴丸有效成分對Hoechst33258染色心肌

5、細胞的凋亡情況。
　　結果：①麝香通心滴丸對垂體后葉素造模建立的大鼠心肌缺血模型的影響。實驗結果表明麝香通心滴丸能顯著性抑制ST段的抬高(P＜0.05)，顯著降低血液中LDH和CK-MB的含量(P＜0.05)，明顯改善心肌組織損傷，降低心肌細胞凋亡數(shù)(P＜0.05)。并且麝香通心滴丸下調了Bax的表達，上調了PI3K、p-Akt和Bcl-2的表達，與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。②麝香通心滴丸對Na2S2O4誘導建立的

6、H9c2心肌細胞缺血缺氧模型的影響。用50μg/ml和25μg/ml濃度的麝香通心滴丸預給藥12h，作為有效作用濃度和時間，加入1mmol/ml Na2S2O4干預4h，復氧6h，作為誘導心肌細胞凋亡的有效作用濃度和時間。各組干預后，麝香通心滴丸各濃度組的心肌細胞形態(tài)改善，明顯好于Na2S2O4模型組，凋亡細胞減少，細胞的存活率顯著性高于Na2S2O4模型組(P＜0.05);減少了心肌細胞的凋亡率，不同程度地下調了Bax的表達，上調了P

7、I3K、p-Akt和Bcl-2的表達，與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。③麝香通心滴丸抗心肌缺血的藥效物質基礎的初步研究。建立最佳色譜和質譜條件，分析并鑒定麝香通心滴丸揮發(fā)性化學成分17個，主要是麝香酮、龍腦和異龍腦等;非揮發(fā)性成分41個，主要為膽酸類、人參皂苷類、丹酚酸類和蟾蜍二烯羥酸內酯類化合物等。對主要化學成分進行活性篩選，結果表明，有效成分麝香酮、龍腦、異龍腦、膽酸、人參皂苷Rg1和Rg3等能不同程度地增強缺血缺氧心肌