基于RNA-Seq技術(shù)對血鏈球菌spxA2敲除株的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、目的:血鏈球菌是人類口腔常駐菌群，屬于條件致病菌，常見于牙菌斑，是引起感染性心內(nèi)膜炎(infective endocarditis，IE)的罪魁禍首，其致病性與其在各種應(yīng)激環(huán)境下的耐受情況密切相關(guān)。spx蛋白是一組全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在低GC含量的革蘭氏陽性菌中高度保守，對細菌的應(yīng)激耐受、生存、毒力和致病過程起到重要的作用。其中，spxA1與spxA2互為同系物，雖然二者結(jié)構(gòu)高度相似，但卻行駛著不同的生理學功能。spxA1參與細菌胞外多

2、糖的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)過氧化氫的釋放;而spxA2在感受態(tài)的形成及細菌生存能力方面發(fā)揮一定作用。目前，spxA2在血鏈球菌致病中的具體調(diào)控機制尚不清楚。近年來，高通量測序技術(shù)以通量大、精度高、成本低廉等優(yōu)勢迅速得到普及，這為通過RNA-Seq技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組學奠定了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組學研究有助于了解特定生命過程中相關(guān)基因的整體表達情況，進而從轉(zhuǎn)錄水平初步揭示該生命過程的代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機理。本實驗借助高通量測序平臺，通過轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，揭示spxA2蛋

3、白在分子水平對下游靶基因的全局調(diào)控，以期對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制做出合理推測，為對血鏈球菌致病機制的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1、用剛果紅平板法檢測細菌粘多糖(exopolysaccharides，EPS)的產(chǎn)生。將血鏈球菌SK36野生株、spxA1/spxA2突變株和互補株在剛果紅平板上連續(xù)劃線，分別厭氧培養(yǎng)16、24、36小時，觀察菌落顏色變化。2、將血鏈球菌SK36野生株、spxA1/spxA2突變株和互補株分別接種于BHI液體

4、培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)16小時，1∶30稀釋，40rpm振蕩培養(yǎng)，用亞鐵氰化鐵平板法檢測H2O2生成量。3、通過計算轉(zhuǎn)化率評估細菌的自然感受能力。先用新鮮配制的TH1∶100稀釋血鏈球菌SK36、spxA2突變株和spxA2互補株的過夜培養(yǎng)物，待其長至OD≈0.1，加入1μg染色體DNA，繼續(xù)培養(yǎng)2～3小時，用無菌中性磷酸鹽緩沖液(PBS)倍比稀釋，分別涂到BHI平板和帶卡那霉素的抗性平板上，觀察菌落計數(shù)(Colony-Forming

5、 Units，CFU)并計算轉(zhuǎn)化率。4、采用高通量測序技術(shù)對血鏈球菌野生株和spxA2突變株進行轉(zhuǎn)錄組分析，將測序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)mapping到SK36參考基因組上，獲得各個基因的表達信息，應(yīng)用基因組比對結(jié)果進行基因定量。利用edgeR軟件分析△spxA2和WT中的基因差異表達情況。基于GOTermFinder軟件，找出差異表達基因中顯著富集GO條目，并推測差異表達基因行駛的主要生物學功能;利用Pathway分析進一步了解差異表達基因所參

6、與的代謝通路及其具體的生物學意義。5、隨機抽取若干差異表達基因，通過實時定量PCR對基因的差異表達情況進行驗證。
　　結(jié)果:1、spxA1突變株在剛果紅平板上生長到24小時，菌落顏色較血鏈球菌野生株開始明顯變黑，36小時后突變株菌落顏色與野生株和互補株相比，顯著變黑;而spxA2突變株與野生株和互補株比較，沒有顯著變化。2、spxA1突變株在亞鐵氰化鐵平板上較血鏈球菌野生株幾乎不產(chǎn)生H2O2，而spxA2突變株不影響H2O2的產(chǎn)生

7、。3、spxA2缺失突變株轉(zhuǎn)化率僅為0.023±0.008×10-5，而野生株與互補株轉(zhuǎn)化率無顯著差異。4、通過對構(gòu)建的6個文庫進行測序，每個文庫獲得超過7000000條高質(zhì)量的序列信息，約16.5Gb的數(shù)據(jù)量。de novo拼接后，獲得1350條unigene，所得序列總長度約2.3Mb，平均長度為1675bp，N50長度為3542bp。測序深度趨于飽和，滿足后續(xù)分析對于數(shù)據(jù)量的要求;測序序列實際覆蓋度分布呈現(xiàn)均勻化，基因組上大部分基

8、因已被覆蓋。5、將序列數(shù)據(jù)與血鏈球菌SK36標準株基因組比對，比對上參考基因組的reads占總reads的比例在93.2％以上。通過與公共數(shù)據(jù)庫COG、GO、KEGG、NR、NT和Swiss-Pro的BLAST比對，89.1％（1203個）unigene得到功能注釋。其中，859個unigene注釋到COG并被劃分到25個功能類別，910個unigene注釋到GO數(shù)據(jù)庫，707個(52.4％) unigene被歸為KEGG中的32條代謝

9、途徑。6、對△spxA2組和WT組進行基因表達差異分析，確定spxA2基因敲除株有17個基因表達量顯著上升，5個基因表達量顯著下降。對兩組篩選到的差異基因進行GO功能顯著性富集和Pathway顯著性富集分析，結(jié)果表明，差異表達基因主要富集在氨基酸代謝生物學過程和酶活性細胞組分，共得到2條顯著富集的代謝通路，涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝及?；撬岷团；撬岽x。7、實時熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)本研究spxA2基因敲除株SSA1398表達量

10、顯著低于野生株，SSA_2096、SSA_2351表達量均明顯高于野生株，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致，但SSA_1615在野生株與突變株中的表達量沒有顯著性差異，與測序所得變化趨勢不同，有待進一步驗證。
　　結(jié)論:1、從細菌的表型上看，spxA2行駛的功能不同于spxA1。spxA2調(diào)控血鏈球菌感受態(tài)的形成，而不參與EPS和H2O2的產(chǎn)生（spxA1參與調(diào)控細菌EPS和H2O2，而不參與細菌感受態(tài)的形成）。2、RNA-Seq所得序列數(shù)據(jù)