輔助降血脂益生乳酸菌的篩選及其對(duì)高血脂大鼠腸道菌群的影響.pdf

1、本文從廣西巴馬長(zhǎng)壽地區(qū)的人群腸道中分離篩選出體外輔助降血脂能力較強(qiáng)的乳酸菌，并研究其在高血脂大鼠體內(nèi)的降血脂效果以及對(duì)高血脂大鼠腸道菌群的影響，從而探索乳酸菌在體內(nèi)降血脂的可能機(jī)制，并為以腸道菌群為靶點(diǎn)進(jìn)行的益生菌干預(yù)治療提供理論依據(jù)。
　　1.利用選擇性培養(yǎng)基從廣西巴馬長(zhǎng)壽地區(qū)人群采集的糞便樣品中分離乳酸菌，通過(guò)體外試驗(yàn)篩選出降膽固醇及甘油三酯能力較強(qiáng)的乳酸菌，然后進(jìn)行模擬人工胃液、膽鹽耐受性、抑菌及耐藥性試驗(yàn);并研究其生長(zhǎng)菌體

2、、熱致死菌體及休眠菌體的膽固醇降解率及其在體外的降膽固醇方式。結(jié)果表明，從15份糞便樣品中分離獲得156株乳酸菌，其中Lp2、S10、Lf7及Hsryfm1301等16株乳酸菌的膽固醇及甘油三酯的降解率均分別大于30.35％和5.33％，Lp2、S10、Lf7及Hsryfm1301在pH3.0的人工胃液中存活率均大于63.00％，在含0.1％、0.3％及0.5％膽鹽的培養(yǎng)基中存活率均大于15.00％; Hsryfm1301的抑菌能力較強(qiáng)

3、于Lp2、S10及Lf7，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為14.67mm、11.35mm及10.67mm; Hsryfm1301的耐藥性低于Lp2、S10及Lf7，對(duì)頭孢唑啉、頭孢拉定、四環(huán)素、氯霉素、利福平素均敏感，對(duì)鏈霉素中度敏感，對(duì)青霉素G、諾氟沙星及環(huán)丙沙星均耐藥;Hsryfm1301在含0.1％、0.3％及0.5％膽鹽的培養(yǎng)基中的降膽固醇能力較強(qiáng)于Lp2、S10及Lf7，降解率分別為56.25％、28.9

4、1％及13.20％; Lp2、S10、Lf7及Hsryfm1301的生長(zhǎng)菌體、熱致死菌體及休眠菌體均能降低培養(yǎng)基中的膽固醇，Hsryfm1301生長(zhǎng)菌體的膽固醇降解率為61.90％，高于Lp2、S10及Lf7; Hsryfm1301體外降膽固醇的主要方式為菌體吸收及共沉淀，分別占其總降解率的62.50％及36.50％。經(jīng)API及16S rDNA測(cè)序?qū)sryfm1301鑒定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）

5、。
　　2.通過(guò)飼喂4周高脂飼料來(lái)建立高血脂大鼠模型，以降血脂藥物血脂康作為陽(yáng)性對(duì)照，研究L.rhamnosus hsryfm1301的菌體懸浮液、熱致死菌體懸浮液、菌體破碎液及其發(fā)酵乳在高血脂大鼠體內(nèi)的降血脂效果。結(jié)果表明，飼喂4周高脂飼料，模型組大鼠血清中的膽固醇(Serum total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglycerides，TG)及低密度脂蛋白(Lowdensity lipoprotein c

6、holesterol，LDL-C)含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，分別為2.05mmol/L、1.98mmol/L、0.28mmol/L，表明高血脂大鼠模型建模成功;灌胃4周L.rhamnosus hsryfm1301發(fā)酵乳后，大鼠對(duì)飼料的利用率顯著高于模型組(P＜0.05)，為29.46％;飼喂8周高脂飼料后，模型組大鼠的肝指數(shù)及體脂指數(shù)均顯著高于對(duì)照組及L.rhamnosus hsryfm1301各處理組(P＜0.05)，分別為

7、3.98和3.55。
　　灌胃4周L.rhamnosus hsryfm1301的各處理方式后，菌體懸浮液組及發(fā)酵乳組大鼠血清中TC、TG的含量顯著低于模型組（P＜0.05），分別為1.50mmol/L、1.30mmol/L及1.53mmol/L、1.28mmol/L;菌體熱致死組大鼠血清中TC、高密度脂蛋白(High density lipoproteincholesterol，HDL-C)及LDL-C的含量顯著低于模型組（P＜0

8、.05），分別為1.90mmol/L、0.38mmol/L及0.19mmol/L;菌體破碎液組大鼠血清中TC、TG及LDL-C的含量顯著低于模型組(P＜0.05)，分別為1.78mmol/L、1.68mmol/L及0.17mmol/L;灌胃4周的血脂康后，大鼠血清中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量也顯著低于模型組(P＜0.05)，分別為1.76mmol/L、1.65mmol/L、0.39mmol/L及0.19mmol/L。

9、>　　灌胃4周L.rhamnosus hsryfm1301的菌體懸浮液、菌體破碎液及其發(fā)酵乳后，大鼠血清中氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)濃度顯著高于模型組(P＜0.05)，分別為74.96U/mL、73.58U/mL及73.96U/mL，而熱致死菌體對(duì)大鼠血清中的SOD濃度影響較小;菌體懸浮液組及發(fā)酵乳組大鼠糞便中膽固醇、甘油三酯和膽汁酸的含量顯著高于模型組(P＜0.05)，分別為10.23μmol/g

10、、4.25μ mol/g和28.87μmol/g及9.85μ mol/g、4.03μ mol/g和27.13μmol/g;菌體懸浮液組、菌體破碎液組與發(fā)酵乳組大鼠糞便中的水分含量顯著高于模型組(P＜0.05)，分別為46.15％、45.35％及46.85％;通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，L.rhamnosushsryfm1301菌體懸浮液、菌體破碎液及其發(fā)酵乳均能預(yù)防由高血脂引起的大鼠肝臟和心臟組織的病變。
　　3.利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變

11、性梯度凝膠電泳技術(shù)研究基礎(chǔ)飼料、高脂飼料及L.rhamnosus hsryfm1301的菌體懸浮液、熱致死菌體懸浮液、菌體破碎液及其發(fā)酵乳對(duì)高血脂大鼠腸道菌群的影響。結(jié)果表明，飼喂4周高脂飼料增加了大鼠腸道中柔嫩梭菌屬PCR-DGGE圖譜的條帶數(shù)，降低了腸道微生物16S rRNA基因V3區(qū)、擬桿菌屬、乳酸菌及雙歧桿菌屬PCR-DGGE圖譜的條帶數(shù)，而L.rhamnosus hsryfm1301的各處理方式對(duì)大鼠腸道微生物的影響正好與之相

12、反。
　　飼喂4周基礎(chǔ)飼料及高脂飼料后，大鼠腸道中Klebsiella pneumoniae及Unculturedbacterium的豐度下降甚至消失，同時(shí)增加了大鼠腸道中柔嫩梭菌的種類(lèi)，而對(duì)照組大鼠腸道中的UnculturedBacteroidetes bacterium TM1-40消失。試驗(yàn)第9周，灌胃4周L.rhamnosus hsryfm1301菌體懸浮液后，大鼠腸道中出現(xiàn)了Pantoea vagans及Clostrid

13、ium thermocellum，對(duì)照組及模型組大鼠腸道中出現(xiàn)了Streptomyces coelicolor及Clostridiales genomo sp.，對(duì)照組大鼠腸道中Clostridium botulinum A str.Hall的豐度高于其它組;熱致死菌體懸浮液、菌體破碎液及其發(fā)酵乳使大鼠腸道中Ruminococcus bromii L2-63的豐度下降或消失，菌體懸浮液增加了大鼠腸道中Lactobacillus amyl

14、ovorus GRL的豐度，菌體破碎液增加了大鼠腸道中Lactobacillusbuchneri NRRL B-30929的豐度，發(fā)酵乳則增加了大鼠腸道中Lactobacillus sp.的豐度;菌體懸浮液、菌體破碎液及發(fā)酵乳還增加了大鼠腸道中乳酸菌的種類(lèi)，分別為L(zhǎng)actobacillusmurinus DLM3108、Lactobacillus gasseri ATCC33323及Lactobacillus sakei subsp.。

15、
　　4.利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time ploymerase chain reaction，RT-PCR)的方法研究基礎(chǔ)飼料、高脂飼料及L.rhamnosus hsryfm1301的菌體懸浮液、熱致死菌體懸浮液、菌體破碎液及其發(fā)酵乳對(duì)高血脂大鼠腸道菌群的影響，并分析高血脂大鼠的腸道菌群與其血清血脂水平的相關(guān)性。結(jié)果表明，飼喂8周基礎(chǔ)飼料顯著增加了大鼠腸道中擬桿菌和腸球菌的數(shù)量(P＜0.05)，飼喂8周高脂脂飼

16、料顯著增加了大鼠腸道中柔嫩梭菌、腸球菌以及腸桿菌的數(shù)量(P＜0.05)，同時(shí)顯著降低了擬桿菌、乳酸菌及雙歧桿菌的數(shù)量(P＜0.05);L.rhamnosus hsryfm1301各處理方式干預(yù)4周后，菌體懸浮液顯著增加了大鼠腸道中擬桿菌及乳酸菌的數(shù)量(P＜0.05)，并顯著降低了柔嫩梭菌的數(shù)量(P＜0.05);熱致死菌體懸浮液顯著增加了大鼠腸道中擬桿菌及腸球菌的數(shù)量(P＜0.05)，并顯著降低了柔嫩梭菌及腸桿菌的數(shù)量(P＜0.05);菌