游離二氧化硅誘導(dǎo)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及其時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系.pdf

1、背景和目的：
　　有關(guān)肝、腎等纖維化疾病的研究表明，肌成纖維細(xì)胞是分泌膠原纖維的主效應(yīng)細(xì)胞，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化是其主要來(lái)源之一。矽肺的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，但已知矽肺的纖維化過(guò)程中，肌成纖維細(xì)胞同樣是合成、分泌膠原纖維的主效應(yīng)細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞的來(lái)源除了肺內(nèi)固有的成纖維細(xì)胞外，其他來(lái)源也同樣受到重視。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有一定的分化能力，有可能是肌成纖維細(xì)胞的潛在來(lái)源之一。迄今為止，在矽肺過(guò)程中，二氧化硅（SiO2）粉塵如何誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型

2、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的機(jī)制、效率以及轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系尚不確定。因此，本研究構(gòu)建了體外共培養(yǎng)模型和大鼠矽肺模型，應(yīng)用電子透射電鏡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、激光共聚焦成像、Western blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探索體內(nèi)外肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的過(guò)程及其時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，為矽肺的機(jī)制闡釋提供了新的思路，為矽肺的監(jiān)測(cè)和干預(yù)提供了參考。
　　方法：
　　1.提取原代肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AECⅡ）和AM，購(gòu)買(mǎi)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)

3、胞株（RLE-6TN），并對(duì)AECⅡ和RLE-6TN進(jìn)行電子透射鑒定。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)，用1~140μg/mL的SiO2濃度梯度染塵24、48和72h，確定染塵濃度。
　　2.建立體外共培養(yǎng)模型，AECⅡ細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，RLE-6TN分為直接對(duì)照組、直接染塵組、間接對(duì)照組和間接染塵組。采用western blot和qRT-PCR技術(shù)測(cè)定不同分組24、48和72h時(shí)AECⅡ和RLE-6TN中GAPDH、E-cad和α-SM

4、A的蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)測(cè)定24、48和72h時(shí)AECⅡ、RLE-6TN的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的含量。
　　3.建立大鼠矽肺模型，選擇SPF級(jí)4~6周齡的雄性健康SD大鼠84只，體重在160~180g之間，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，通過(guò)非氣管暴露法進(jìn)行 SiO2染塵，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和染塵組，對(duì)照給予等量的生理鹽水，每組6只，并在實(shí)驗(yàn)的1、2、3、4、6、9和12周時(shí)處死相應(yīng)的大鼠

5、。采用HE染色法判斷大鼠矽肺模型是否成功；采用激光共聚焦熒光雙染技術(shù)，檢測(cè)肺組織冰凍切片中E-cad和α-SMA的定位及表達(dá)水平，采用ELISA測(cè)定大鼠矽肺組織研磨液中TGF-β1的含量。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS21.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（?±s）表示，雙因素?cái)?shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，單因素?cái)?shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），均數(shù)的兩兩比較采用最

6、小顯著差法（LSD檢驗(yàn)），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.原代AECⅡ和RLE-6TN的電子透射電鏡顯示，細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)均可見(jiàn)特異性的板層小體。CCK-8測(cè)定SiO2對(duì)細(xì)胞抑制率顯示，同一染毒條件下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越強(qiáng)，同一染塵時(shí)間時(shí)，隨著染塵濃度的增大抑制作用增強(qiáng)，約在最長(zhǎng)染塵時(shí)間72h時(shí)抑制率達(dá)到50％，此時(shí)的SiO2濃度約為100μg/mL。
　　2.原代AECⅡ的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，蛋白E-ca

7、d和α-SMA的相對(duì)表達(dá)水平的差異顯著（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組E-cad和α-SMA的相對(duì)表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中TGF-β1的含量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且實(shí)驗(yàn)組TGF-β1的變化具有明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，其最大值為1.42ng/mL。
　　3.RLE-6TN細(xì)胞的直接染塵組與直接對(duì)照組、間接染塵組與間接對(duì)照組相比，E-cad和α-SMA的蛋白和mRNA水平

8、的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且具有明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；直接染塵組和間接染塵組均可使E-cad的蛋白和mRNA水平表達(dá)下降而α-SMA的表達(dá)上升，間接染塵組 E-cad下降和α-SMA上升的時(shí)間早于直接染塵組。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，TGF-β1的含量在直接染塵組與直接對(duì)照組、間接染塵組與間接對(duì)照組差異顯著（P<0.05），間接染塵組和直接染塵組中均具有明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，其最大值為1.81ng/mL。
　　4.HE染色顯

9、示，在2周時(shí)可見(jiàn)染塵組肺組織有明顯的炎性細(xì)胞聚集，3周時(shí)肌纖維逐漸減少，膠原纖維增多，特別是在3周以后，可見(jiàn)膠原纖維聚集成團(tuán)，形成細(xì)胞性結(jié)節(jié)，6周有纖維性結(jié)節(jié)出現(xiàn)，之后結(jié)節(jié)逐漸增大融合，甚至出現(xiàn)肺間隔斷裂。染塵組肺組織研磨液中TGF-β1的含量在2周時(shí)達(dá)到最大值，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；免疫熒光雙染顯示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在2周時(shí)E-cad的表達(dá)達(dá)到最大值，之后逐漸下降，而α-SMA呈現(xiàn)隨時(shí)間逐漸上升的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　游離