鈣化性納米微粒通過ROS-JNK信號通路介導(dǎo)細(xì)胞的自噬和凋亡.pdf

1、目的:鈣化性納米微粒（calcifying nanoparticles，CNPs）在腎結(jié)石形成過程中起到重要的作用，但其確切的作用機制目前仍不清楚。本文旨在探討草酸鈣腎結(jié)石患者中段尿中培養(yǎng)的CNPs對腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用及其機制，從而了解CNPs在腎結(jié)石形成過程中起到的作用。
　　方法:收集草酸鈣腎結(jié)石患者(n=20)及健康人(n=10)中段尿進行體外培養(yǎng)并分離CNPs;應(yīng)用透射電子顯微鏡(transmission elect

2、ronmicroscopy TEM)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy SEM)分析CNPs的形態(tài)特征及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，X-射線能譜分析(energy-dispersiveX-ray microanalysis EDX)分析CNPs的主要元素組成，免疫印跡法(Westernblotting WB)檢測CNPs中胎球蛋白A的表達情況，通過電泳和布朗運動視頻分析觀察培養(yǎng)的CNPs的粒徑分布及其電位情況。通

3、過透射電鏡觀察草酸鈣結(jié)石患者腎乳頭鈣化斑中CNPs存在情況。CNPs(2 MCF)與腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）分別共培養(yǎng)0h，12h及72h后通過CCK-8(The Cell CountingKit-8)檢測細(xì)胞活性，并用流式細(xì)胞儀檢測活性氧(Reactive oxygen speciesROS)的表達情況、線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential MMP)的變化。Ad-mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)

4、腺病毒轉(zhuǎn)染后的HK-2與CNPs共培養(yǎng)12h后通過激光共聚焦顯微鏡觀察HK-2的自噬流變化情況。CNPs干預(yù)72小時后流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。CNPs干預(yù)后通過TEM觀察HK-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化并觀察HK-2的自噬和凋亡現(xiàn)象。WB分析細(xì)胞內(nèi)蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1、從草酸鈣結(jié)石患者的中段尿中可以培養(yǎng)出CNPs，經(jīng)多種方法鑒定其形態(tài)與經(jīng)典描述一致。CNPs的粒徑集中在130nm左右，并檢測出CNPs具有負(fù)電位。C

5、NPs中包含胎球蛋白-A(Fetuin-A)。在腎乳頭鈣化斑的超薄切片中可以觀察到與培養(yǎng)的CNPs形態(tài)具有高度的相似性;
　　2、CCK-8檢測結(jié)果顯示CNPs干預(yù)后HK-2的細(xì)胞活力隨干預(yù)的時間增加下降。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果提示CNPs可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，并檢測到HK-2的線粒體膜電位下降。
　　3、我們通過Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染實驗觀察到CNPs干預(yù)的早期(12h) HK-2既可以發(fā)生自噬現(xiàn)象。流式細(xì)

6、胞術(shù)檢測到CNPs干預(yù)72h后細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞超薄切片透射電子顯微鏡圖像顯示HK-2可以通過吞噬作用內(nèi)吞CNPs，細(xì)胞內(nèi)的CNPs包裹于囊泡內(nèi)，細(xì)胞線粒體腫脹，并可以觀察到自噬、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壞死等征象。
　　4、CNPs干預(yù)后Bcl-2蛋白的表達下降，而Bax的表達明顯升高，自噬指示蛋白LC3-B和Beclin-1表達水平明顯增高，通路蛋白p-JNK/JNK表達水平增加(12h)。
　　結(jié)論:
　　1、草酸

7、鈣腎結(jié)石患者的中段尿中可以培養(yǎng)出CNPs，中段尿的培養(yǎng)可以作為泌尿系有無感染CNPs的方法;CNPs可以通過內(nèi)吞囊泡的方式進入HK-2細(xì)胞，CNPs的負(fù)電位可能在內(nèi)吞過程中起到作用;
　　2、CNPs為晶體蛋白復(fù)合物，其復(fù)制增殖是一種以蛋白為載體的鈣磷沉積仿生行為;
　　3、吞噬后的CNPs可通過作用于線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生;
　　4、CNPs誘導(dǎo)ROS的過度表達可導(dǎo)致HK-2的自噬與凋亡，嚴(yán)重時還可以引起細(xì)胞的