IL-10-hAMSCS局部移植對小鼠創(chuàng)面愈合過程中IL-10、TNF-α、IL-6影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　通過對小鼠皮膚創(chuàng)面組織炎性因子IL-10、TNF-α、IL-6含量變化的檢測，探討IL-10基因修飾的hAMSCs（IL-10-hAMSCs）局部注射移植于小鼠皮膚全層缺損模型后炎癥調(diào)節(jié)的能力及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用價值。
　　方法：
　　采用含小鼠IL-10基因的慢病毒載體LV5-IL-10及空質(zhì)粒載體LV5分別轉(zhuǎn)染hAMSCs，72 h后采用ELISA法分別檢測上述2種轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染hAMSCs細胞的培養(yǎng)上清液

2、中IL-10的含量。采用40只8周齡C57BL/6小鼠制備全層皮膚缺損模型，隨機分為空白組（不制模且不作任何干預(yù)的正常小鼠）、PBS移植組（模型組）、hAMSCs移植組（hAMSCs組）、IL-10-hAMSCs移植組（IL-10-hAMSCs組）、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hAMSCs移植組（空質(zhì)粒-hAMSCs組），每組8只。模型制備采用背部中線2側(cè)各剪取1cm×1cm大小皮膚全層創(chuàng)面的方式進行，隨即根據(jù)分組不同，于每個創(chuàng)面各邊中點距創(chuàng)緣1mm處

3、注射總量100μL PBS懸浮的各組細胞（細胞數(shù)為1×106個），模型組注射等量的PBS。分別于移植后1、3、7、14 d收集創(chuàng)面組織樣本，并分別采用組織HE染色觀察組織炎癥細胞浸潤情況；ELISA檢測IL-10、TNF-α、IL-6因子的含量；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Q-PCR）檢測IL-10、TNF-α、IL-6因子的mRNA相對含量變化情況。實驗同時采用CM-Dil標(biāo)記hAMSCs移植，連同IL-10-hAMSCs移植和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、染的hAMSCs移植，分別對不同組別的移植細胞的體內(nèi)定植、存活情況進行示蹤分析。
　　結(jié)果：
　　IL-10慢病毒及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hAMSCs72h后于倒置顯微鏡下觀察可見視野中均高表達綠色熒光，表明感染后轉(zhuǎn)染率高,ELISA法檢測培養(yǎng)基、hAMSCs、IL-10-hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs第72h細胞上清液，結(jié)果顯示hAMSCs、IL-10-hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs組均有分泌IL-10，IL-10-hAMS

5、Cs較hAMSCs組與空質(zhì)粒-hAMSCs組分泌多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HE結(jié)果顯示：在顯微鏡下觀察正常小鼠皮膚組織可見上皮完整，無炎性細胞，伴有毛囊且膠原排列有序呈網(wǎng)狀；1d時觀察模型組、hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組創(chuàng)面創(chuàng)緣均可見大量炎性細胞集中浸潤，模型組炎癥反應(yīng)最重，壞死組織最多，其次為hAMSCs組和空質(zhì)粒-hAMSCs組，IL-10-hAMSCs組炎癥反應(yīng)程度最輕，壞死組織

6、最少。3d時觀察模型組、hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組創(chuàng)面創(chuàng)緣均可見大量炎性細胞彌散浸潤，對各組進行炎性細胞計數(shù)可知，模型組炎性細胞浸潤最多，IL-10-hAMSCs組炎性細胞浸潤最少，相對其他三組炎性細胞計數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；7d時各組炎性細胞均有所減少，模型組炎性細胞浸潤最多，IL-10-hAMSCs組炎性細胞浸潤最少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；14d時hAMSCs組、空質(zhì)

7、粒-10-hAMSCs組及IL-10-hAMSCs組未見明顯炎性細胞浸潤，模型組仍有少量炎性細胞浸潤，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　ELISA法和qPCR檢測小鼠背部創(chuàng)面及創(chuàng)緣組織結(jié)果顯示IL-10含量及mRNA相對表達量：結(jié)果可見空白組正常小鼠皮膚組織IL-10極低，1d、3d模型組、hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組含量逐漸增高，3d達到峰值后逐漸下降；1d、3d、7d、14d，IL

8、-10-hAMSCs組IL-10含量及mRNA相對表達量均高于其他組，差異具有統(tǒng)計學(xué)有意義（P＜0.05），結(jié)果提示：IL-10-hAMSCs可以上調(diào)IL-10的表達；TNF-α含量及mRNA相對表達量：1d、3d模型組、hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組含量逐漸增高，3d達到峰值后逐漸下降；1d、3d、7d、14d，模型組TNF-α含量及mRNA相對表達量均高于其他幾組，與其他組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜

9、0.05），IL-10-hAMSCs組TNF-α含量及mRNA相對表達量均低于其他幾組，比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。IL-6含量及mRNA相對表達量：1d、3d、7d、14d，模型組IL-6含量及mRNA相對表達量均高于其他組，比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而IL-10-hAMSCs組IL-6含量及mRNA相對表達量在各時相點均低于其他組，比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)果表明IL-10-hAMSCs可下調(diào)TNF-α

10、及IL-6的表達。以上細胞因子的表達規(guī)律及形式均與HE染色病理結(jié)果基本相呼應(yīng)。于移植14天后，熒光示蹤顯示未轉(zhuǎn)染的hAMSCs、IL-10轉(zhuǎn)染的hAMSCs及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hAMSCs仍然存活。
　　結(jié)論：
　　1.IL-10-hAMSCs體外培養(yǎng)能夠高表達和分泌IL-10。
　　2.創(chuàng)面局部移植IL-10-hAMSCs能夠通過上調(diào)IL-10含量的表達及下調(diào)TNF-α及IL-6含量的表達，減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)程度，有可能對創(chuàng)