海洋產(chǎn)毒素細(xì)菌的篩選和產(chǎn)毒機(jī)理的初步研究.pdf

1、海洋微生物毒素資源豐富，是海洋天然產(chǎn)物的重要組成部分，也是海洋生物活性物質(zhì)研究中進(jìn)展最迅速的領(lǐng)域。海洋微生物所產(chǎn)毒素具有化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、新穎多樣，活性廣泛且活性強(qiáng)，作用機(jī)理特殊等優(yōu)點(diǎn)。因而，從廣闊無垠的海洋中發(fā)掘各類海洋毒素及產(chǎn)毒細(xì)菌逐漸引起了人們的重視。目前，國內(nèi)外以海洋生物毒素為主要成分開發(fā)成功的醫(yī)藥產(chǎn)品已經(jīng)在臨床上得到應(yīng)用，海洋細(xì)菌毒素在生物醫(yī)藥基礎(chǔ)研究和臨床治療中將一直占有一席之地，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，海洋毒素和產(chǎn)毒素細(xì)菌的

2、發(fā)掘與研究才是一切應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。
　　本研究用216L、Zobell2216E和普通海水瓊脂等培養(yǎng)基從來自南大西洋、印度洋、太平洋和北極的海底沉積物與近海海水樣品中分離出97株海洋細(xì)菌。這些海洋細(xì)菌分布于交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、深海螺旋菌屬（Thalassospira）、海桿菌屬（Marinobacter）葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鹽單胞菌屬（Hal

3、omonas）、海洋桿狀菌屬（Maricaulis）、埃希氏菌屬（Escherichia）、假蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）、球形芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）和短狀桿菌屬（Brachybacterium）等12個屬。并通過統(tǒng)計(jì)種屬的分布情況，分析了深海沉積物樣品和近海海水樣品細(xì)菌多樣性的差異。
　　在分離培養(yǎng)獲得海洋細(xì)菌后，采用血平板法測試法和MTT細(xì)胞毒性

4、試驗(yàn)法進(jìn)行了產(chǎn)海洋生物毒素菌株的篩選。從血平板中挑出能在菌落周圍形成2~4 mm、界限分明的溶血圈具有溶血現(xiàn)象的菌株。共篩選出能產(chǎn)生溶血素的菌株10株。再對余下不溶血的菌株進(jìn)行發(fā)酵，取發(fā)酵液過濾除菌，然后用無菌發(fā)酵液處理HEK-293細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性檢測。通過此方法篩選出3株具有明顯細(xì)胞毒性的菌株。
　　從上述的產(chǎn)毒菌株中挑選出一株未見毒素研究相關(guān)報(bào)道的深海螺旋菌（Thalassospira xianhensis）SDM1-

5、7作為研究對象。首先，通過分析不同溫度下深海螺旋菌溶血現(xiàn)象的差異，發(fā)現(xiàn)隨著溫度上升菌株的溶血現(xiàn)象加強(qiáng)。然后，通過生物信息學(xué)分析比對發(fā)現(xiàn)Thalassospira xianhensis基因組中含有hlyA同源基因。與Rhodospirillum rubrum ATCC11170中hlyA基因的相似度為87%。隨之通過半定量RT-PCR技術(shù)，分析溶血素Hemolysin A的hlyA基因在不同溫度下的基因表達(dá)差異。最后，利用 SDS-PAG