羧肽酶Y標(biāo)記蛋白質(zhì)羧基端方法的優(yōu)化及其應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　蛋白質(zhì)水解作為一種重要的翻譯后修飾，在細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等生物化學(xué)過程中起著極其重要的作用。鑒定蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)可以進(jìn)一步加深我們對(duì)這些生化過程的認(rèn)識(shí)。近年來，鑒定蛋白質(zhì)水解的氨基端蛋白質(zhì)組學(xué)方法層出不窮，但羧基端組學(xué)方法卻很少。本課題中，我們首先將對(duì)蛋白質(zhì)羧基端生物酶標(biāo)記（ProC-TEL）和親和純化效率兩個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的ProC-TEL和正向分離羧基端多肽方法應(yīng)用到E.coli全蛋白樣品中，以期對(duì)蛋白質(zhì)

2、復(fù)雜樣品的羧基端多肽進(jìn)行正向分離富集并用質(zhì)譜鑒定。其次，將優(yōu)化后的ProC-TEL和正向分離的方法應(yīng)用到藥物誘導(dǎo)凋亡的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞樣品中，鑒定凋亡過程中蛋白質(zhì)的水解。最后，探索數(shù)個(gè)羧肽酶Y突變體在ProC-TEL中的應(yīng)用，探尋轉(zhuǎn)肽酶活性更好的羧肽酶Y突變體，從而對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行高效的羧基端標(biāo)記。
　　方法：
　　蛋白質(zhì)C端羧肽酶Y標(biāo)記方法是首個(gè)正向標(biāo)記分離蛋白質(zhì)C端多肽的方法。本課題中，通過優(yōu)化該方法中生物素標(biāo)記反應(yīng)的p

3、H值以獲得標(biāo)記產(chǎn)物均一的實(shí)驗(yàn)條件；通過研究SDS含量對(duì)生物素標(biāo)記效率的影響，對(duì)羧肽酶Y標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化；通過對(duì)E.coli全蛋白復(fù)雜樣品羧基端親和標(biāo)記、親和純化和質(zhì)譜鑒定，對(duì)復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)進(jìn)行高通量檢測(cè)；利用臺(tái)盼藍(lán)染色法、CCK-8檢測(cè)法和Western blotting檢測(cè)5，6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的調(diào)控；聯(lián)合優(yōu)化后的ProC-TEL技術(shù)、親和純化和質(zhì)譜鑒定對(duì)藥物誘導(dǎo)的多

4、發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞凋亡過程中的水解進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；通過羧肽酶Y突變體的構(gòu)建、表達(dá)及其在生物素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，篩選可能提高生物素標(biāo)記效率的突變體羧肽酶Y，進(jìn)行羧肽酶Y介導(dǎo)的生物素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1）通過對(duì)比模型肽Ac-ASLTDYVKSYGA在不同pH條件下生物素標(biāo)記樣品的MALDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在pH=11.5的反應(yīng)條件下，生物素標(biāo)記產(chǎn)物較為均一。
　　2）通過增加生物素標(biāo)記體系中反應(yīng)緩沖

5、液中SDS的含量和甲基酯化反應(yīng)后復(fù)溶緩沖液中SDS的含量，從Western blotting檢測(cè)和銀染結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系中SDS含量為0.5％時(shí)為最佳生物素標(biāo)記條件。
　　3）通過MALDI-TOF-MS以及LC-MS/MS結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的ProC-TEL技術(shù)聯(lián)合親和純化以及質(zhì)譜分析能夠正向分離檢測(cè)單一蛋白質(zhì)C端多肽。
　　4）用優(yōu)化后的羧基端標(biāo)記方法來標(biāo)記E.coli復(fù)雜蛋白樣品羧基端，純化后共鑒定到了120多個(gè)蛋白質(zhì)

6、羧基端多肽。
　　5）用優(yōu)化后的ProC-TEL技術(shù)檢測(cè)100?M DRB加藥處理6 h誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤OPM2細(xì)胞凋亡過程中的水解，DMSO對(duì)照組共檢測(cè)到了81個(gè)生物素標(biāo)記多肽，DRB加藥組共鑒定出了88個(gè)生物素標(biāo)記多肽，并發(fā)現(xiàn)多個(gè)凋亡酶水解底物蛋白。
　　6）在探索實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)盡管野生型以及突變體羧肽酶Y可以在原核表達(dá)體系中成功表達(dá)，但其介導(dǎo)的生物素標(biāo)記效率并沒有明顯提高。
　　結(jié)論：
　　優(yōu)化后的ProC

7、-TEL技術(shù)可以更好地聯(lián)合親和純化及質(zhì)譜鑒定對(duì)蛋白質(zhì)的羧基端多肽進(jìn)行正向分離和鑒定。在E.coli復(fù)雜蛋白樣品中鑒定出了31個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)部水解位點(diǎn)，有多個(gè)水解蛋白可能在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成以及氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。由于產(chǎn)生的新的N端多肽太長或太短，這些蛋白質(zhì)水解后約有48%的水解位點(diǎn)不能被氨基端組學(xué)的方法鑒定出來。其次，優(yōu)化后的ProC-TEL在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡過程中鑒定出了11個(gè)新的凋亡酶水解位點(diǎn)。
　　綜上所述，本課題優(yōu)