HBX蛋白與炎癥微環(huán)境M2巨噬細(xì)胞共同介導(dǎo)EMT促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、研究目的：
　　探討HBX蛋白和炎癥微環(huán)境M2巨噬細(xì)胞對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力影響。
　　研究方法：
　　1.構(gòu)建含HBX基因的慢病毒載體感染Hep3B細(xì)胞與THP-1來源M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組：感染組（Hep3B+、Hep3B++M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)）、非感染組（Hep3B-、Hep3B-+對照載體LV5、Hep3B-+對照載體LV5+M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)、Hep3B-+M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)）。

2、r>　　3.采用蛋白質(zhì)印跡檢測共培養(yǎng)前后Hep3B細(xì)胞上皮標(biāo)志物和間葉標(biāo)志物表達(dá)變化。
　　4.激光共聚焦雙免疫熒光進(jìn)一步分析共培養(yǎng)前后Hep3B細(xì)胞EMT標(biāo)記分子定位及表達(dá)變化。
　　5.通過transwell實(shí)驗(yàn)檢測感染組與非感染組Hep3B細(xì)胞侵襲能力。
　　研究結(jié)果：
　　1.HBX病毒成功感染靶細(xì)胞：重組慢病毒感染Hep3B細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到HBX慢病毒和對照病毒組的Hep3B細(xì)胞上表達(dá)GFP，

3、證明慢病毒成功的感染到了細(xì)胞中。在第3天時，GFP陽性率最高，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇感染3天的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象。WB檢測到病毒感染后，HBX表達(dá)明顯增強(qiáng)
　　2.感染HBX蛋白Hep3B細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的Western Blot結(jié)果：HBX/LV5成功轉(zhuǎn)染到Hep3B細(xì)胞內(nèi)，并證實(shí)在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)HBX蛋白（Hep3B+）。Hep3B+與M2共培養(yǎng)72h后，經(jīng)Western Blot檢測發(fā)

4、現(xiàn)Hep3B+E-cadherin表達(dá)（0.42±0.11）較Hep3B-（1.00±0.18）明顯下調(diào)（t=4.762，P<0.05）， N-cadherin表達(dá)（2.85±0.44）較Hep3B-（1.00±0.17）明顯上調(diào)（ t=6.793，P<0.05）。Hep3B++M2 E-cadherin（0.1±0.13）表達(dá)較Hep3B+顯著下調(diào)（t=3.255，P<0.05）， N-cadherin表達(dá)（4.18±0.52）較He

5、p3B+顯著上調(diào)（t=10.009，P<0.05）；非感染組E-cadherin【（Hep3B-為1±0.18，Hep3B-+ LV5為1.12±0.23，Hep3B-+ LV5+M2為0.66±0.19，Hep3B-+M2為0.78±0.19）,F=3.302, P>0.05】和N-cadherin【（Hep3B-為1.00±0.17，Hep3B-+ LV5為,0.81±0.19，Hep3B-+M2+ LV5為1.25±0.15，He

6、p3B-+M2為1.20±0.22），F(xiàn)=5.304, P>0.05】表達(dá)水平無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；
　　3.激光共聚焦雙免疫熒光分析EMT標(biāo)記分子表達(dá)水平變化及其亞細(xì)胞定位情況：E-cadherin和N-cadherin均表達(dá)于細(xì)胞連接處，E-cadherin在非感染組（Hep3B-、Hep3B-+M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組）紅色免疫熒光清晰可見(E-cadherin↑)，在感染組（Hep3B+、）紅色免疫熒光明顯變（E-c

7、adherin↓）,Hep3B++M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組紅色免疫熒光接近消失；N-cadherin在非感染組（Hep3B-、Hep3B-+M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組）紅色免疫熒光微弱，在感染組（Hep3B+、）紅色免疫熒光顯示明顯(N-cadherin↑)，Hep3B++M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組紅色免疫熒光進(jìn)一步增強(qiáng)(N-cadherin↑↑)。
　　4. HBX蛋白和 M2巨噬細(xì)胞對 Hep3B細(xì)胞侵襲能力影響：感染組 Hep3B+組(26

8、1±15.62）較非感染對照組Hep3B-(70.33±19.75)的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.115,P<0.05）；感染組中Hep3B++M2（335.33±24.218）較Hep3B+侵襲能力顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.467,P<0.05），而非感染組（Hep3B-組70.33±19.75, Hep3B-+M2組109.33±31.62）侵襲能力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.812,P