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文檔簡介
1、目的:通過觀察分析促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)作用于阿霉素(ADR)誘導(dǎo)損傷的足細胞后nephrin、podocin、actin以及cdc42蛋白表達的變化,來初步探討cdc42信號蛋白在ACTH保護足細胞的具體地位作用。
方法:1.足細胞復(fù)蘇與培養(yǎng):將凍存于液氮中的條件永生型小鼠足細胞E11細胞快速融化后于33℃中增殖培養(yǎng),3~4天傳代一次,然后取生長至約90%的足細胞,胰酶消化后傳于T75瓶,于37℃無γ-干擾素條件下培養(yǎng)
2、10 d使其分化,此時觀察足細胞生長分化形態(tài),若狀態(tài)良好時可用于試驗。
2.實驗分組:將足細胞分為六組:正常對照組,阿霉素處理組(濃度為1μmol/L的阿霉素處理24小時),ACTH處理組(濃度為1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的ACTH分別處理1h), ZCL278處理組(50uM ZCL278處理1h),阿霉素+ACTH處理組(濃度為1μmol/L的阿霉素處理24小時后再分別加入濃度為1ng/ml、10ng/
3、ml、100ng/ml的ACTH分別處理1h),阿霉素+ACTH+ZCL278處理組(濃度為1μmol/L的阿霉素處理24小時后再分別加入濃度為1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的ACTH分別處理1h,然后再加入50uM ZCL278分別處理1h)。
3.檢測指標:采用RT-PCR方法檢測nephrin、podocin、actin以及cdc42蛋白表達;采用Western-blotting技術(shù)對nephrin、po
4、docin、actin以及cdc42蛋白表達進行檢測。
結(jié)果:與正常對照組對比,阿霉素處理組nephrin和podocin的mRNA及蛋白表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而cdc42和actin的mRNA及蛋白表達未有明顯降低。與正常對照組對比,ZCL278處理組cdc42和actin的mRNA及蛋白表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而nephrin和podocin的mRNA及蛋白表達未有明顯
5、降低。與正常對照組對比,中濃度ACTH處理組nephrin和podocin的mRNA及蛋白表達升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而cdc42和actin的mRNA及蛋白表達未有明顯升高。與低濃度和高濃度ACTH處理組相比,中濃度ACTH處理組nephrin和podocin的mRNA及蛋白表達升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與阿霉素處理組相比,中濃度阿霉素+ACTH處理組nephrin和podocin的mRNA及蛋白表達
6、明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而cdc42和actin的mRNA及蛋白表達未有明顯升高。與正常對照組對比,阿霉素+ACTH+ZCL278處理組cdc42和actin的mRNA及蛋白表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:足細胞的nephrin和podocin結(jié)構(gòu)蛋白是ACTH保護足細胞的的基礎(chǔ),但這種保護作用并不是通過影響cdc42信號蛋白來表現(xiàn)的,但相信我們的研究能對未來的相關(guān)研究提供一些思
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