雙酯型烏頭堿致心肌細胞自發(fā)性鈣釋放機制研究.pdf

1、附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根加工品。在臨床使用中，附子被廣泛應(yīng)用于治療心力衰竭、急性心肌梗死、休克、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、關(guān)節(jié)炎等疾病，取得了良好療效。在基礎(chǔ)研究方面，根據(jù)對附子中次生代謝產(chǎn)物研究表明其主要有生物堿、附子脂酸、脂肪酸酯等成分。其中，生物堿類主要包括新烏頭堿(mesaconitine，MAC)、烏頭堿(aconitine，AC)、次烏頭堿(hypaconiti

2、ne，HAC)、去甲烏藥堿(higenamine)、烏頭原堿等。在臨床廣泛應(yīng)用與治療各種疾病的同時，附子也因其毒性在臨床應(yīng)用中受到較大限制?，F(xiàn)代研究則提出，附子的主要活性成分烏頭類生物堿既是附子的藥效成分，也是主要的毒性成分。烏頭類生物堿尤其是雙酯型二萜類生物堿，如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等的毒性較大。
　　上述三種雙酯型烏頭堿在以往研究中以烏頭堿報道最多。烏頭堿毒性主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，對心臟的毒性最為明顯。在心

3、臟上可出現(xiàn)多形性心律失常，如單源室性早搏、單源多形室性早搏、室速及室顫，病人常因心律失常及呼吸中樞麻痹死亡。烏頭堿能夠影響電壓依賴性鈉通道，在去極化過程中抑制鈉通道構(gòu)象改變，使得鈉通道維持激活狀態(tài)，膜電位持續(xù)去極化。但烏頭堿所致的心律失常不能單純用促進Na+電流內(nèi)流來解釋。觸發(fā)活動(TA)是一種重要的心律失常誘發(fā)機制，因為其與自主性相關(guān)的自發(fā)去極化有關(guān)，包括早期后去極化(EAD)和延遲后去極化(DAD)。DADs不但可引發(fā)觸發(fā)沖動，其也

4、可直接導(dǎo)致自主性的心律失常。人們認為遲后除極(DADs)是在胞內(nèi)Ca2+的積累狀態(tài)下由肌漿網(wǎng)自發(fā)釋放出Ca2+形成的。當(dāng)前研究認為烏頭堿致心率失常主要通過Nac-NCX途徑:烏頭堿導(dǎo)致鈉通道(Na+ channel，NaC)開放時間增加，鈉離子持續(xù)進入細胞內(nèi)，使細胞內(nèi)鈉離子濃度增加，通過鈉鈣交換體(Na+/Ca2+ exchanger，NCX)逆向轉(zhuǎn)運使細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載，從而誘發(fā)心律失常;肌漿網(wǎng)的鈣釋放過程中，過量

5、的Ca2+也會通過NCX貢獻了胞內(nèi)Na+的去極化活動。如果內(nèi)流的Na+足夠產(chǎn)生DAD振幅的話，從而誘發(fā)一次新的細胞膜去極化。烏頭堿對上述NaC-NCX途徑結(jié)果，可以使動作電位時程(action potentialduration，APD)延長，進而出現(xiàn)遲后除極和觸發(fā)活動。
　　在臨床應(yīng)用中，單純的阻斷鈉通道僅能部分抑制心室動過速，有報道提出使用鈣通道拮抗劑在藥效上優(yōu)于使用鈉通道拮抗劑。在興奮收縮耦聯(lián)(excitation-cont

6、raction coupling，ECC)過程中，細胞膜去極化引起L型鈣通道開放，使外鈣進入細胞內(nèi)，通過一種以鈣致鈣(calcium-induced calcium release，CICR)的方式激活RyR2將肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣大量釋放。當(dāng)胞內(nèi)鈣離子過度增加時，造成鈣超載，誘發(fā)鈣波的頻率增加，從而引起心率失常。有報道指出烏頭堿誘導(dǎo)的心率失?？赡芨鶵yR2的激活有直接的關(guān)系。最近的報道指出，烏頭堿能夠下調(diào)SERCA的蛋白表達，其可能使細胞在興奮

7、收縮耦聯(lián)中不能及時消除胞漿內(nèi)的鈣離子而造成胞質(zhì)內(nèi)的鈣聚集從而導(dǎo)致RyR開放頻率增加，或者在肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣含量增高時，RyR對鈣離子的敏感性增加導(dǎo)致肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)鈣泄漏(calcium leak)增大，從而更容易誘發(fā)不節(jié)律鈣釋放。烏頭堿通過多種途徑能夠引起細胞內(nèi)鈣離子增加可能是出現(xiàn)心律失常的一個原因，或使細胞RyR2對鈣敏感性增加，更容易觸發(fā)鈣自肌漿網(wǎng)內(nèi)釋放，但這一結(jié)論尚無直接的證據(jù)證明。

8、　　綜上，本研究考察三種雙酯型烏頭堿對心肌細胞鈣釋放的影響，分別從毒性作用即誘導(dǎo)細胞自發(fā)性鈣釋放(spontaneous calcium release，SCR)、鈣瞬變以及正性肌力作用角度考察藥物的效應(yīng)。探尋烏頭堿導(dǎo)致自發(fā)性鈣釋放與升高細胞內(nèi)鈣、肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣含量、肌漿網(wǎng)鈣泄漏以及興奮收縮耦聯(lián)中SERCA和NCX的功能變化的關(guān)系，研究鈣穩(wěn)態(tài)失衡的機制，闡述烏頭堿的毒性機理。通過阻斷鈉通道、鈣通道、鈉鈣交換體以及腎上腺素能受體，檢測能夠有效

9、消除烏頭堿對心肌細胞自發(fā)性鈣釋放的干預(yù)方式，從鈣轉(zhuǎn)運角度闡述鈣穩(wěn)態(tài)失衡對心律失常的影響。
　　同時本研究亦篩選具有潛在消除烏頭堿心臟毒性的中藥組分，主要包括已報道具有阻斷上述離子通道或受體作用的中藥單體或配伍組分。以期找到能夠有效消除烏頭堿致自發(fā)性鈣釋放的中藥組分，為臨床增效或減毒應(yīng)用提供依據(jù)。
　　第一部分三種雙酯型烏頭堿對心肌細胞鈣釋放研究
　　目的:研究三種雙酯型烏頭堿（烏頭堿，新烏頭堿，次烏頭堿）對心肌細胞鈣釋

10、放的毒效關(guān)系，包括心肌細胞自發(fā)性鈣釋放的誘發(fā)率、舒張末期鈣濃度(F0)、鈣瞬變幅度(ΔF)以及收縮功能的研究。
　　方法:急性分離成年SD大鼠左心室肌細胞，分別使用0.3μmol·L-1，1μmol·L-1，3μ mol·L-1的上述三種雙酯型烏頭堿灌流細胞12分鐘，檢測持續(xù)搏動細胞在灌流4min、8min、12min時間點隨時間依賴性及濃度依賴性SCR誘發(fā)率及對細胞F0、ΔF的變化。檢測0.3μmol·L-1上述三種藥物在12

11、min發(fā)揮正性肌力作用時鈣瞬變和收縮功能動力學(xué)的同步變化，分析其毒性和藥效作用關(guān)系。
　　結(jié)果:三種雙酯型烏頭堿均能誘發(fā)心肌細胞出現(xiàn)自發(fā)性鈣釋放，其中在低濃度(0.3μmol·L-1)時新烏頭堿即引起較高的誘發(fā)率，但高濃度（3μmol·L-1）時烏頭堿的誘發(fā)率能達到三者最大。三種烏頭堿也能夠濃度依賴性增加舒張末期鈣濃度及鈣瞬變幅度，新烏頭堿效應(yīng)最強，次烏頭堿效應(yīng)最弱。三種烏頭堿在低濃度（0.3μmol·L-1）時均能增加心肌收縮力

12、及鈣瞬變幅度和速率，尤其對舒張期的功能提高更明顯。
　　結(jié)論:三種雙酯型烏頭堿的正性肌力作用與產(chǎn)生自發(fā)性鈣釋放毒性效應(yīng)同時存在，表明藥物作用于心肌細胞是毒效并存，細胞內(nèi)鈣濃度升高是產(chǎn)生正性肌力作用的有利因素但同時也是誘發(fā)自發(fā)性鈣釋放的危險因素。
　　第二部分烏頭堿對心肌興奮收縮耦聯(lián)毒性機制研究及干預(yù)
　　目的:檢測烏頭堿對心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)過程中鈣轉(zhuǎn)運影響;檢測干擾觸發(fā)活動中關(guān)鍵離子通道和受體對烏頭堿誘發(fā)自發(fā)性鈣釋放

13、影響。
　　方法:急性分離成年SD大鼠左心室肌細胞，研究0.3μmol·L-1濃度下12min時烏頭堿對持續(xù)搏動狀態(tài)下心肌細胞內(nèi)鈣，鈣瞬變，SERCA和NCX功能、肌漿網(wǎng)鈣容量及鈣泄漏影響。分析鈉通道、鈣通道、鈉鈣交換體、腎上腺素能受體阻斷下1 mol·L-1烏頭堿在12min時誘導(dǎo)心肌細胞SCR發(fā)生率、舒張末期鈣濃度(F0)、鈣瞬變幅度(ΔF)的變化。
　　結(jié)果:烏頭堿能夠加快心肌細胞舒張期的鈣消除速率，同時增強SERCA

14、和NCX的活性并增加肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣容量并造成肌漿網(wǎng)鈣泄漏水平增加。顯著增加鈣瞬變過程中鈣從肌漿網(wǎng)釋放占肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量的比例。烏頭堿主要通過NaC-NCX途徑增加鈣離子濃度并誘發(fā)自發(fā)性鈣釋放。利多卡因、KB-R7943及其聯(lián)合應(yīng)用下，烏頭堿誘導(dǎo)的心肌細胞舒張期鈣濃度、自發(fā)性鈣釋放發(fā)生率均發(fā)生下降且三者之間無顯著性差異。利多卡因能夠明顯降低鈣瞬變幅度但仍高于正常細胞。硝苯地平能夠降低SCR發(fā)生率同時大幅降低鈣瞬變幅度。L-型鈣通道貢獻了鈣自發(fā)

15、性釋放過程，但并非主導(dǎo)因素。腎上腺素能受體介導(dǎo)的信號通路參與了烏頭堿調(diào)控NaC-NCX之外的調(diào)節(jié)。阻斷腎上腺素能受體能夠有效消除烏頭堿致SCR發(fā)生率。聯(lián)合應(yīng)用AR阻斷劑和鈉通道阻滯劑能夠達到消除SCR最佳效果。
　　結(jié)論:烏頭堿能夠引起心肌細胞鈣轉(zhuǎn)運紊亂，使肌漿網(wǎng)鈣庫容量增高，鈣泄漏增加。阻斷鈉通道和腎上腺素能受體能夠有效消除烏頭堿導(dǎo)致的自發(fā)性鈣釋放。第三部分中藥組分與烏頭堿配伍增效減毒作用
　　目的:篩選具有消除烏頭堿致自

16、發(fā)性鈣釋放的中藥組分，為臨床增效或減毒應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:急性分離成年SD大鼠左心室肌細胞，研究在不同中藥組分的干預(yù)下0.3μmol·L-1烏頭堿12min時對持續(xù)搏動狀態(tài)下心肌細胞SCR發(fā)生率、舒張末期鈣濃度(F0)、鈣瞬變幅度(ΔF)的影響變化。中藥組分主要來自于以往報道具有鈉通道、鈣通道、鈉鈣交換體或者腎上腺素能受體抑制作用的單體或配伍。
　　結(jié)果:篩選的15種中藥單體在10uM濃度時均未能有效消除烏頭堿導(dǎo)致的自