基于Rho激酶的藥物設(shè)計(jì)和分子模擬研究.pdf

1、Rho激酶（ROCK1和ROCK2）屬于AGC家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Rho蛋白下游效應(yīng)因子，其通過(guò)磷酸化下游的效應(yīng)蛋白（MLC、Lin-11、Isl-1、LIMK、ERM、MARCKS、CRMP-2等）來(lái)實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。大量的研究證明，ROCKs參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等，因此 ROCKs被認(rèn)為是一類重要的藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。盡管大量的ROCKs小分子抑制劑已經(jīng)被報(bào)道，但大都不

2、是理想的先導(dǎo)化合物，目前僅有法舒地爾在日本被批準(zhǔn)上市用于治療腦血管痙攣和缺血。因此，研發(fā)和設(shè)計(jì)新穎的、藥效強(qiáng)的以及副作用小的ROCKs抑制劑具有非常重要的意義。
　　本論文首先采用分子對(duì)接的方法對(duì)ChemBridge和Specs化合物數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物進(jìn)行篩選。接著，挑選并購(gòu)買了174個(gè)化合物進(jìn)行ROCK1激酶活性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，其中12個(gè)類藥性化合物顯示出微摩范圍的抑制活性（IC50值在7μM到28μM之間），并且在體外具有明

3、顯的抑制肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞增值的活性；最后結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示2個(gè)化合物（化合物13和24）具有新穎的結(jié)構(gòu)。此外，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物24在斑馬魚體內(nèi)能夠有效地預(yù)防及治療阿托伐他汀引起的腦出血，可以作為治療腦出血疾病的潛在候選先導(dǎo)化合物。
　　在第三和第四章中，采用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、MM/GBSA結(jié)合自由能計(jì)算和自由能分解的方法，從原子水平研究了ROCK1與三嗪類抑制劑以及LIMK2與吡咯并嘧啶類抑制劑的

4、結(jié)合模式，研究了蛋白受體在與抑制劑結(jié)合過(guò)程中構(gòu)象的動(dòng)態(tài)變化，并分析了受體重要氨基酸殘基及抑制劑的不同取代基對(duì)抑制劑結(jié)合的作用。根據(jù)理論預(yù)測(cè)的結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列新穎的抑制劑，并且對(duì)設(shè)計(jì)抑制劑進(jìn)行理論的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些抑制劑表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合親和力，可能具有更優(yōu)的活性。
　　在第五章中，我們對(duì)虛擬篩選得到的ROCK抑制劑FPND的預(yù)防腦出血機(jī)制進(jìn)行了深入的藥效學(xué)和藥理學(xué)研究。FPND具有新穎的骨架結(jié)構(gòu)并且在微摩爾的濃度下具有明顯的抑制

5、活性。首先我們采用分子動(dòng)力學(xué)模擬、MM/GBSA結(jié)合自由能計(jì)算和自由能分解方法對(duì)FPND對(duì)ROCK1和ROCK2的選擇性抑制的根源進(jìn)行了探討；結(jié)果發(fā)現(xiàn)FPND與ROCK1和ROCK2之間的結(jié)合親和力的差異主要是由非極性能量項(xiàng)貢獻(xiàn)的。在斑馬魚模型中，我們發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)阿托伐他汀誘導(dǎo)的腦出血具有明顯的保護(hù)作用以及顯著防止內(nèi)皮細(xì)胞破裂的作用；最后，xCELLigence RTCA系統(tǒng)分析，免疫熒光和Western印跡分析的結(jié)果表明這種預(yù)防及保

6、護(hù)的作用是通過(guò)抑制 ROCK/MYPT1/MLC2、ROCK/LIMK/絲切蛋白和Src/VEC信號(hào)通路來(lái)完成的。總而言之，F(xiàn)PND是一個(gè)低毒安全的，并能有效的預(yù)防腦出血的候選先導(dǎo)化合物。
　　在最后一章中，我們采用并行虛擬篩選以及相似性搜索的篩選策略對(duì)Chembridge化合物進(jìn)行了虛擬篩選，并結(jié)合子結(jié)構(gòu)匹配方法獲得及挑選了79個(gè)可能的ROCK1小分子抑制劑。激酶抑制實(shí)驗(yàn)證明其中有21個(gè)化合物對(duì)ROCK1具有明顯的抑制活性，其中