原花青素通過(guò)NrF-2信號(hào)通路對(duì)大鼠肌腱抗氧化應(yīng)激作用的研究.pdf

1、目的：原花青素可以通過(guò)上調(diào)Nrf-2通路明顯的抑制氧化應(yīng)激對(duì)多種組織器官造成的損傷，但該作用在肌腱組織中鮮見(jiàn)報(bào)道。本文旨在研究原花青素對(duì)肌腱抗氧化應(yīng)激的作用，初步明確原花青素的抗氧化作用機(jī)制，為肌腱損傷的發(fā)病機(jī)制及治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：一、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1、從SD大鼠肌腱組織中提取肌腱干細(xì)胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第3代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)提取

2、的TDSCs進(jìn)行細(xì)胞種類(lèi)鑒定。3、以不同濃度的原花青素(Proanthocyanidins，PCs)單獨(dú)作用于TDSCs，排除PCs對(duì)TDSCs的毒副作用。4、以不同濃度的H2O2作用于TDSCs，摸索構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的最佳濃度——半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。5、將半抑制濃度的H2O2作用于經(jīng)不同濃度的PCs預(yù)處理的TDSCs，并通過(guò)CCK-8法來(lái)測(cè)定TDSCs的細(xì)

3、胞活性。6、應(yīng)用Real Time-PCR法及Western Blot法檢測(cè)PCs對(duì)TDSCs中Nrf-2基因及其下游GCLM、HO-1、NQO-1基因表達(dá)的影響。二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1、取15只成年雄性SD大鼠，分為空白組、對(duì)照組（過(guò)度使用模型組）、實(shí)驗(yàn)組(PCs預(yù)處理+過(guò)度使用組)三組，每組5只。2、對(duì)空白組、對(duì)照組中的大鼠僅以滅菌水灌胃，而實(shí)驗(yàn)組則以100mg/kg PCs灌胃。3、將SD大鼠放置于大鼠跑臺(tái)上，以17m/min的速度進(jìn)行1

4、0°的上坡跑，每天進(jìn)行1h，每周進(jìn)行5天，以建立肌腱過(guò)度使用的模型。在進(jìn)行正式模型建立之前，進(jìn)行5天適應(yīng)訓(xùn)練。4、建立模型2周后取大鼠眼球血血清，進(jìn)行氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、抗·OH及抗O2·-的測(cè)定。5、取SD大鼠肌腱組織，行病理切片HE染色。
　　結(jié)果：1、分離的TDSCs在P3呈紡錘狀、多角狀等形態(tài)生長(zhǎng)，并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其表面標(biāo)記物測(cè)定結(jié)果顯示，有96.8％的細(xì)胞對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD90（陽(yáng)性標(biāo)記物）高表達(dá)，僅有0.

5、65％對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31表達(dá)（陰性標(biāo)記物），并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果證實(shí)分離細(xì)胞為T(mén)DSCs。2、在CCK-8試驗(yàn)中，不同濃度的PCs單獨(dú)作用于TDSCs，細(xì)胞活性無(wú)明顯差異，證實(shí)PCs對(duì)TDSCs無(wú)明顯毒副作用。且在H2O2的處理下，經(jīng)PCs預(yù)處理的TDSCs細(xì)胞活性明顯高于H2O2組，且各濃度PCs組之間的細(xì)胞活性無(wú)明顯差異，證實(shí)PCs在低濃度狀態(tài)下即可發(fā)揮出強(qiáng)大的抗氧化作用。3、在RT-PCR檢測(cè)中，與對(duì)照組相比，H2O2和PCs的

6、單獨(dú)作用都可上調(diào)TDSCs中Nrf-2及其下游基因GCLM、NQO-1、HO-1的表達(dá)，且PCs的作用更明顯，而PCs+ H2O2組的各個(gè)基因表達(dá)均達(dá)到最高水平。4、在WB檢測(cè)中，雖然在各種組中Nrf-2的蛋白表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在各組間的表達(dá)中呈上升的趨勢(shì)。而GCLM及HO-1的表達(dá)在H2O2、PCs、PCs+ H2O2三組中的表達(dá)依次增高，與RT-PCR結(jié)果一致。5、在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，過(guò)度使用組MDA水平明顯增高，表明大鼠肌腱過(guò)度使

7、用模型造模成功，且SOD活性、抗·OH及抗O2·-能力在過(guò)度使用組中均有相應(yīng)增強(qiáng)。而PCs組中MDA水平較過(guò)度使用組明顯降低，顯示出PCs的抗氧化作用，同時(shí)SOD活性、抗·OH及抗O2·-能力也得到了較大的增強(qiáng)。6、在大鼠肌腱的病理切片中，低倍鏡(100×)下可見(jiàn)在正常肌腱組織內(nèi)，肌腱纖維蛋白組織互相平行，且相互排列緊密有序。在高倍鏡(400×)下可見(jiàn)細(xì)胞核深染且呈紡錘型或梭型，位于肌腱纖維蛋白組織中央。而在過(guò)度使用組中，可見(jiàn)到肌腱纖維

8、蛋白組織明顯的紊亂甚至斷裂，而細(xì)胞核變圓且著色加深。經(jīng)PCs處理的大鼠肌腱組織，在病理切片中可見(jiàn)比較明顯的結(jié)構(gòu)紊亂，排列稀疏，但未見(jiàn)明顯的肌腱纖維斷裂。雖然實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞核也有向圓形發(fā)展的趨勢(shì)，但仍可見(jiàn)少量梭型或紡錘形的細(xì)胞核。可見(jiàn)經(jīng)PCs處理后肌腱組織在形態(tài)學(xué)上較過(guò)度使用組有明顯的改觀(guān)。
　　結(jié)論：1、PCs單獨(dú)作用于TDSCs時(shí)無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用，且能通過(guò)上調(diào)TDSCs中Nrf-2的表達(dá)，從而進(jìn)一步上調(diào)其下游基因GCLM、NQ