正清風(fēng)痛寧聯(lián)合甲氨蝶呤干預(yù)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的機制研究.pdf

1、目的：
　　 1．確認(rèn)正清風(fēng)痛寧和甲氨蝶呤單用及聯(lián)用對于RA骨破壞的抑制作用強度；
　　 2．從炎癥及RANKL系統(tǒng)解釋正清風(fēng)痛寧聯(lián)合甲氨蝶呤對抗骨破壞的可能機制。
　　 方法：
　　 1．酶消化法進行RA滑膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，本實驗采用5-10代滑膜成纖維細(xì)胞。分為4組并作以下處理：空白對照組，MTX組（濃度0.1mg/ml），正清風(fēng)痛寧組（濃度0.1mg/ml），聯(lián)合組（正清風(fēng)痛寧+MTX，各加濃度

2、0.1mg/ml）。采用蘇木精一伊紅染色比較不同藥物對滑膜成纖維樣細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測不同藥物對滑膜成纖維樣細(xì)胞凋亡的影響；RT-PCR測定RANKLmRNA的表達。
　　 2．建立Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的SD大鼠關(guān)節(jié)炎模型，隨機分為模型組（生理鹽水灌胃）、MTX組(3.8mg/kg/w灌胃)、聯(lián)合組（正清風(fēng)痛寧+MTX組，正清風(fēng)痛寧130mg/kg/d和MTX3.8mg/kg/w灌胃），另設(shè)7只作為正常對照組。采用關(guān)

3、節(jié)評分法評估關(guān)節(jié)炎癥程度，并用ELISA法分析大鼠血清中OPG、RANKL、IL-1α、IL-6、MMP-3，MMP-13的表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．加藥組對滑膜細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)的改變，光鏡下見滑膜細(xì)胞出現(xiàn)凋亡表現(xiàn)，形態(tài)異常；熒光顯微鏡下見滑膜細(xì)胞出現(xiàn)核質(zhì)濃集，有明顯的凋亡小體。
　　 2．加藥組對滑膜細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：空白對照組25.3％，MTX組28.4％，正清風(fēng)

4、痛寧組32.3％，聯(lián)合組34.7％，說明加藥組凋亡細(xì)胞百分率均明顯高于空白對照組。
　　 3.RT-PCR結(jié)果顯示：各組RANKL電泳條帶均較空白組弱；聯(lián)合組OPG電泳條帶較空白組強。相對灰度值計算結(jié)果顯示，聯(lián)合組與其余各組相比，其RANKL比值最小，OPG比值最大；MTX組與正清風(fēng)痛寧組之間比值相似。
　　 4．造模后，大鼠關(guān)節(jié)炎腫脹程度在第21d最為明顯，然后逐漸消退，在第35d左右會出現(xiàn)第2個炎癥高峰，MTX組和聯(lián)

5、合組均可減輕關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分在第46d與造模組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)。
　　 5．與模型組比較，MTX組和聯(lián)合組均可明顯抑制大鼠血清IL-1α、IL-6的表達水平，與MTX組相比聯(lián)合組血清IL-1α，IL-6的表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05);MTX組和聯(lián)合組都可明顯抑制血清MMP-3和MMP-13的表達水平，同時聯(lián)合組血清MMP-3的表達水平低于MTX組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)

6、。
　　 6．與模型組比較，MTX組、聯(lián)合組均提高OPG的表達水平，升高OPG與RANKL的比值；聯(lián)合組可降低血清RANKL的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)；聯(lián)合組與MTX組比較，血清RANKL的表達水平下降更為明顯，OPG與RANKL的比值也有顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．對體外培養(yǎng)的RA患者成纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，正清風(fēng)痛寧與MTX聯(lián)合體外給藥能夠協(xié)同促進滑膜成

7、纖維細(xì)胞凋亡，并且對RANKL及OPGmRNA的表達有顯著影響，說明正清風(fēng)痛寧聯(lián)合MTX能夠促進滑膜成纖維細(xì)胞凋亡，并影響OPG-RANKL系統(tǒng)的平衡調(diào)節(jié)。
　　 2．對CIA大鼠誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型病變的研究發(fā)現(xiàn)，正清風(fēng)痛寧與MTX聯(lián)合給藥對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹有明顯的防治效應(yīng)，能夠較好地控制炎癥發(fā)生發(fā)展，可能與其對血清IL-1α、IL-6等炎性因子的抑制作用有關(guān)；正清風(fēng)痛寧與MTX可協(xié)同延緩骨破壞的發(fā)生，可能與其通過對MMP-3、