心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭及肌梭傳入神經(jīng)的影響與機制研究.pdf

1、現(xiàn)代社會的高速發(fā)展、日趨激烈的社會競爭、以及快節(jié)奏的生活狀態(tài)使越來越多的人們承受著各種生理、心理上的應(yīng)激。越來越多的系統(tǒng)性疾病被證實與心理應(yīng)激、過度的精神壓力存在著相關(guān)關(guān)系?？陬M肌是口頜系統(tǒng)的重要組成部分，具有維持下頜穩(wěn)定、參與咀嚼運動、以及參與下頜發(fā)育的重要功能。大量研究結(jié)果表明，異常的心理狀態(tài)與口頜肌的結(jié)構(gòu)功能異常存在著相關(guān)關(guān)系，包括口頜肌疲勞、疼痛敏感、微結(jié)構(gòu)和功能等一系列變化。本課題組前期研究結(jié)果證實，心理應(yīng)激能夠激活腦內(nèi)控制下

2、頜運動的相關(guān)核團，并且興奮性遞質(zhì)谷氨酸傳遞增強，使得口頜肌肌緊張度升高，直接或間接導(dǎo)致其病理變化。在口頜肌，尤其是深層咬肌內(nèi)，含有較多的本體覺感受器肌梭，肌梭的主要功能是感知肌肉的牽拉、張力、運動速率的變化等，并將這些本體覺信息傳遞至神經(jīng)中樞而做出反應(yīng)。研究表明，咬肌肌梭傳入神經(jīng)與腦內(nèi)頜面部運動相關(guān)核團形成復(fù)雜的神經(jīng)聯(lián)系，是參與口頜肌牽張反射、調(diào)節(jié)口頜肌運動的重要組成部分。咬肌肌梭傳入神經(jīng)元屬于假單極神經(jīng)元，其細胞體位于腦干部位的三叉神

3、經(jīng)中腦核（Mesencephalic trigeminal nucleus，Vme），是全身唯一一類胞體位于腦內(nèi)的初級傳入神經(jīng)元，因此，Vme神經(jīng)元的興奮性不僅受到口頜肌的牽張變化所影響，還同時被一系列來自于腦內(nèi)其他部位的神經(jīng)終末投射所調(diào)節(jié)。研究證實，肌梭傳入神經(jīng)元屬于谷氨酸能神經(jīng)元，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸以及其相關(guān)受體在肌梭傳入神經(jīng)傳導(dǎo)本體覺信息過程中發(fā)揮重要作用。那么，在機體受到心理應(yīng)激時，咬肌肌梭以及肌梭傳入神經(jīng)元會發(fā)生怎樣結(jié)構(gòu)與功

4、能的變化，谷氨酸及其受體又在其中發(fā)揮了怎樣的作用，目前尚未見相關(guān)研究報道。
　　本研究建立大鼠慢性束縛應(yīng)激模型，采用行為學(xué)實驗、ELISA技術(shù)、組織病理染色、全細胞膜片鉗技術(shù)、免疫組織熒光染色、以及透射電鏡等方法，探究了大鼠在慢性心理應(yīng)激狀態(tài)下咬肌肌梭以及肌梭傳入神經(jīng)的一系列變化，并從谷氨酸受體之一N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs）出發(fā)，采用NMDARs抑制劑M

5、K801對其進行拮抗，探討神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸及其受體在這一過程中的作用機制。
　　本研究分為兩部分實驗，具體如下：
　　第一部分：心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭形態(tài)學(xué)及肌梭傳入神經(jīng)元興奮性影響的研究
　　實驗一大鼠心理應(yīng)激模型的建立與評價
　　我們將大鼠采用隨機方法分為四組：對照組，心理應(yīng)激組，低劑量 MK801組（0.1mg/kg），高劑量MK801組（0.2mg/kg）。應(yīng)激組大鼠給予6 h/day的束縛應(yīng)激，持續(xù)14天

6、，建立大鼠慢性心理應(yīng)激模型。藥物組大鼠通過腹腔注射藥物，兩天一次。我們通過體重測定、行為學(xué)檢測以及血清學(xué)檢測驗證動物模型，結(jié)果顯示，心理應(yīng)激組大鼠的體重增長速度明顯減慢；大鼠在曠場中的中央活動距離、總活動路程、移動速率明顯降低；高架十字迷宮中大鼠進入開臂的時間與次數(shù)、以及活動總路程明顯降低；血清皮質(zhì)酮（Corticosterone，CORT）與促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotropic hormone，ACTH）水平明顯升

7、高。而MK801能夠劑量依賴性的減輕動物的應(yīng)激樣行為學(xué)、血清學(xué)變化。本部分實驗結(jié)果證實了慢性束縛應(yīng)激能夠造成大鼠處于心理應(yīng)激狀態(tài)，保證了后續(xù)實驗的進行。
　　實驗二心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭形態(tài)學(xué)影響的研究
　　在本實驗中，我們通過對深層咬肌進行組織學(xué)切片并進行HE染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激以及MK801治療對大鼠深層咬肌的組織學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯的影響作用；并且，心理應(yīng)激或MK801治療對咬肌肌梭的數(shù)目、梭內(nèi)肌纖維數(shù)量、直徑以及肌梭囊

8、壁厚度沒有明顯的影響。以上結(jié)果說明，心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭在光鏡水平下的結(jié)構(gòu)沒有影響作用。
　　實驗三心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭傳入神經(jīng)元興奮性影響的研究
　　在本實驗中，我們通過全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察心理應(yīng)激對咬肌肌梭傳入神經(jīng)元電生理特性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激能夠明顯降低肌梭傳入神經(jīng)元的靜息膜電位（Resting membrane potential，RMP），升高動作電位（Action potential，AP）發(fā)放幅度

9、，延長AP發(fā)放時間，降低后超極化電位（After hyperpolarization，AHP）幅度，并且增加了一定刺激電流下神經(jīng)元的AP發(fā)放頻率。同時，心理應(yīng)激還明顯增加了肌梭傳入神經(jīng)元自發(fā)性興奮性突觸后電流（Spontaneous excitatory postsynaptic current，sEPSC）的頻率與幅度。MK801能夠劑量依賴性拮抗心理應(yīng)激帶來的上述變化。實驗結(jié)果說明，心理應(yīng)激能夠明顯提高肌梭傳入神經(jīng)元的神經(jīng)興奮性。而

10、MK801治療能夠一定程度上減輕心理應(yīng)激對神經(jīng)元興奮性的增強作用。
　　第二部分：心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭及肌梭傳入神經(jīng)元影響的機制研究
　　實驗一心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭及肌梭傳入神經(jīng)元谷氨酸相關(guān)物質(zhì)表達影響的研究
　　在本部分實驗中，我們通過免疫組織熒光染色技術(shù)，從谷氨酸及其受體出發(fā)，觀察心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭傳入神經(jīng)元相關(guān)物質(zhì)表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激能夠增加咬肌肌梭傳入神經(jīng)元外周末梢（肌梭環(huán)螺形末梢）與中樞末梢

11、也就是三叉神經(jīng)運動核（Trigeminal motor nucleus，Vmo）的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體1（Vesicular glutamate transporter of type1，VGLUT1）的表達，同時增加了神經(jīng)元胞體的谷氨酰胺酶2（Glutaminase2，GLS2）的含量。其次，心理應(yīng)激能夠明顯增加Vme內(nèi)神經(jīng)終末的 VGLUT1表達量，并且增加了肌梭傳入神經(jīng)元內(nèi) NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B的表達量。MK

12、801治療對于心理應(yīng)激造成的 VGLUT1陽性終末、以及GLS2的表達升高沒有抑制作用，而對心理應(yīng)激造成的NMDARs表達有明顯的抑制作用。實驗結(jié)果表明，心理應(yīng)激導(dǎo)致了肌梭傳入神經(jīng)元谷氨酸合成與轉(zhuǎn)運的增加，同時其受到的谷氨酸能突觸傳遞也增加，兩者共同作用，導(dǎo)致了Vme神經(jīng)元興奮性的增強。
　　實驗二心理應(yīng)激對大鼠咬肌肌梭傳入神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)影響的研究
　　在本部分實驗中，我們采用透射電鏡技術(shù)，觀察了心理應(yīng)激對Vme部位神經(jīng)元超

13、微結(jié)構(gòu)的影響作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激能夠明顯增加Vme內(nèi)與神經(jīng)元胞體形成的興奮性突觸的數(shù)量、突觸前終末內(nèi)線粒體的數(shù)量、以及突觸后致密區(qū)（Post synaptic density，PSD）的長度與厚度，而心理應(yīng)激對抑制性突觸的數(shù)量以及PSD沒有明顯影響作用。并且 MK801治療能夠明顯降低心理應(yīng)激導(dǎo)致的興奮性突觸 PSD的長度與厚度的增加，但對興奮性突觸以及突觸前終末內(nèi)線粒體的數(shù)量增加沒有明顯的抑制作用。實驗結(jié)果說明，心理應(yīng)激通過增加對

14、Vme神經(jīng)元的興奮性神經(jīng)終末投射作用而增強了肌梭傳入神經(jīng)元的興奮性。
　　研究結(jié)論：
　　束縛應(yīng)激模型造成的心理應(yīng)激狀態(tài)能夠明顯增強大鼠咬肌肌梭傳入神經(jīng)元的興奮性，其結(jié)果導(dǎo)致了咬肌本體覺傳入沖動增強。而谷氨酸作為肌梭傳入神經(jīng)元傳遞信息的主要興奮性遞質(zhì)，其在神經(jīng)元胞體內(nèi)的合成與其向神經(jīng)終末的轉(zhuǎn)運都出現(xiàn)了明顯的增多。同時，心理應(yīng)激還增加了肌梭傳入神經(jīng)元胞體所在部位Vme的谷氨酸能投射，以及NMDARs的表達，并從超微結(jié)構(gòu)的角度證

15、實了心理應(yīng)激確實增加了與Vme神經(jīng)元形成突觸的數(shù)量以及 PSD的長度與厚度。另一方面，NMDARs拮抗劑MK801通過抑制Vme內(nèi)NMDARs的表達量，以及在超微結(jié)構(gòu)下減少PSD的長度與厚度，達到減輕心理應(yīng)激導(dǎo)致肌梭傳入神經(jīng)元興奮增強的作用。因此，本研究結(jié)果為進一步系統(tǒng)深入的研究心理應(yīng)激對口頜肌的影響作用、心因性因素致口頜系統(tǒng)疾患的發(fā)病機理及其防治措施提供理論基礎(chǔ)。
　　本課題的創(chuàng)新點：
　　1.通過建立動物模型，首次探究了