三黃益腎膠囊對(duì)糖尿病大鼠腎臟基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)及腫瘤壞死因子(TNF-α)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、三黃益腎膠囊（制劑準(zhǔn)字號(hào):Z20050795）是滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，用于早期糖尿病腎病臨床，前期已進(jìn)行了部分作用機(jī)制的研究，本課題是在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行作用機(jī)制的深入研究。
　　目的:
　　觀察三黃益腎膠囊對(duì)糖尿病大鼠腎臟基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響，從而了解基于此方面的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用三黃益腎膠囊治療糖尿病腎病提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　將60只清潔

2、級(jí)成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組，正常組10只，造模組50只。造模組大鼠禁食12h后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg（STZ臨用前用0.1M檸檬酸鈉緩沖液配成濃度為1％、pH=4.2的溶液），正常組腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。72h后尾靜脈取血，血糖值≥16.7mmol/L，確定為糖尿病大鼠。造模成功后大鼠隨機(jī)抽取40只，分為模型組（10只）及三黃益腎膠囊低劑量治療組(10只)、三黃益腎膠囊中劑量治療組（10只

3、）、三黃益腎膠囊高劑量治療組（10只）。成模后一周，中藥治療組劑量按人體-大鼠體表面積比值表?yè)Q算出大鼠的等效劑量。三黃益腎膠囊低劑量治療組給予0.4g/(kg·d)灌胃、三黃益腎膠囊中劑量治療組給予0.8g/（kg·d）灌胃、三黃益腎膠囊高劑量治療組給予1.6g/（kg·d）灌胃，每日灌胃1次，連續(xù)8周。正常組和模型組每日給予同等劑量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，環(huán)境溫度為22℃～26℃，濕度45％-65％，實(shí)驗(yàn)期間未

4、使用胰島素和其它降糖藥物。給藥8周后，尾靜脈取血測(cè)血糖。腹腔注射麻醉大鼠，腹部正中切口，腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清甘油三脂(TG)、膽固醇(TC)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血清C反應(yīng)蛋白(CRP)。大鼠取血后取雙腎，去除腎包膜及腎門(mén)結(jié)締組織并用生理鹽水洗凈后稱(chēng)重，得出腎重/體重指數(shù)（腎重/體重×1000）。將腎臟切割成小于0.5cm×0.5cm×0.1 cm的組織塊，置于4％中性福爾馬林溶液中固定、脫

5、水、石蠟包埋、切片厚4μm，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè) MMP-9及TNF-α，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining HE)染色在光鏡下觀察腎小球及腎小管間質(zhì)的病理變化。應(yīng)用SPSS16.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±SD表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用X2檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠一般狀態(tài)的影響
　　正常組大

6、鼠毛色純白，精神狀態(tài)良好，飲水量、進(jìn)食量及尿量均正常，動(dòng)作靈活。各糖尿病組大鼠毛色晦暗無(wú)光澤，明顯消瘦，精神狀態(tài)較差，飲水量、進(jìn)食量及尿量明顯增多，活動(dòng)減少。
　　2、體重的變化
　　造模前各組大鼠的體重相比無(wú)差異(P＞0.05);治療前，與正常組相比，模型組及三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組體重?zé)o明顯變化(P＞0.05)，模型組及三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組間大鼠體重均無(wú)明顯差異（P＞0.05）;經(jīng)灌胃治療8周后，與正

7、常組相比，模型組及三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組體重明顯降低(P＜0.05)，模型組及三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組間體重比較無(wú)差異（P＞0.05）;正常組大鼠治療后體重比治療前明顯增加(P＜0.05)，模型組及三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組間大鼠治療后體重比治療前明顯降低(P＜0.05)。
　　3、對(duì)腎重/體重比的影響
　　經(jīng)灌胃治療8周后，與正常組比較，模型組及三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組腎重/體重比明顯升高(

8、P＜0.05);與模型組比較，三黃益腎膠囊低劑量治療組腎重/體重比無(wú)明顯差別(P＞0.05);中、高劑量治療組腎重/體重比明顯降低(P＜0.05);與三黃益腎膠囊低劑量治療組比較，中、高劑量治療組腎重/體重明顯降低(P＜0.05);中、高劑量治療組比較腎重/體重比無(wú)明顯差別（P＞0.05）。
　　4、生化指標(biāo)的影響
　　4.1 血糖的影響治療前糖尿病各組大鼠血糖與正常組比較，均明顯升高(P＜0.05)，而糖尿病各組間血糖差異

9、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。經(jīng)灌胃治療8周后，各組治療前后血糖相比變化無(wú)明顯差異(P＞0.05);模型組及三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組組間對(duì)比變化無(wú)明顯差異（P＞0.05），與正常組相比較有顯著差異(P＜0.05)。
　　4.2 血清膽固醇、甘油三脂的影響8周后，與正常組比較，模型組、治療組各組大鼠血清甘油三脂、膽固醇水平明顯升高(P＜0.05)。三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組與模型組比較，甘油三脂、膽固醇水平

10、無(wú)明顯差異(P＞0.05)。模型組、三黃益腎膠囊低、中、高劑量治療組間比較膽固醇、甘油三脂無(wú)明顯差異（P＞0.05）。三黃益腎膠囊低劑量治療組與三黃益腎膠囊中、高劑量治療組比較，甘油三脂、膽固醇水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。三黃益腎膠囊中、高劑量治療組間比較，甘油三脂、膽固醇水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　4.3 血清肌酐、尿素氮的影響8周后，與正常組比較，模型組大鼠血清肌酐、尿素氮水平明顯升高（P＜0.05）;三黃益腎膠

11、囊低劑量治療組血清肌酐、尿素氨水平明顯升高(P＜0.05);三黃益腎膠囊中、高劑量治療組血清肌酐、尿素氮水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與模型組比較，三黃益腎膠囊低劑量治療組血清肌酐、尿素氮水平無(wú)明顯差異(P＞0.05);三黃益腎膠囊中、高劑量治療組血清肌酐、尿素氮水平明顯降低(P＜0.05)。與三黃益腎膠囊低劑量治療組比較，三黃益腎膠囊中、高劑量治療組血清肌酐、尿素氮水平有明顯差異(P＜0.05)。三黃益腎膠囊中、高劑量治療組間比較，

12、血清肌酐、尿素氨水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　4.4 血清超敏C反應(yīng)蛋白的影響8周后，與正常組比較，模型組大鼠血清C反應(yīng)蛋白水平明顯升高(P＜0.05);三黃益腎膠囊低劑量治療組血清C反應(yīng)蛋白水平明顯升高（P＜0.05）;三黃益腎膠囊中、高劑量治療組血清C反應(yīng)蛋白水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與模型組比較，三黃益腎膠囊低劑量治療組血清C反應(yīng)蛋白水平無(wú)明顯差異(P＞0.05);三黃益腎膠囊中、高劑量治療組血清C反應(yīng)蛋白水平

13、明顯降低(P＜0.05)。與三黃益腎膠囊低劑量治療組比較，三黃益腎膠囊中、高劑量治療組血清C反應(yīng)蛋白水平明顯降低(P＜0.05)。三黃益腎膠囊中、高劑量治療組間比較，血清C反應(yīng)蛋白水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　5、大鼠腎臟MMP-9及TNF-α的影響
　　MMP-9在正常大鼠腎臟正常表達(dá)，與正常組大鼠比較，模型組表達(dá)明顯降低（P＜0.05）;三黃益腎膠囊低劑量治療組表達(dá)明顯降低(P＜0.05);三黃益腎膠囊中、高劑量

14、治療組表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與模型組大鼠比較，三黃益腎膠囊低劑量治療組表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05);中、高劑量治療組表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。與三黃益腎膠囊低劑量治療組比較，中、高劑量治療組表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。三黃益腎膠囊中、高劑量治療組間比較，表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。TNF-α在正常大鼠腎臟有少量表達(dá)，與正常組大鼠比較，模型組表達(dá)明顯升高(P＜0.05);三黃益腎膠囊低劑量治療組表達(dá)明顯升高(P＜0.

15、05);三黃益腎膠囊中、高劑量治療組表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與模型組比較，三黃益腎膠囊低劑量治療組表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）;三黃益腎膠囊中、高劑量治療組表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。與三黃益腎膠囊低劑量治療組比較，三黃益腎膠囊中、高劑量治療表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。三黃益腎膠囊中、高劑量治療組組間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　6、腎臟組織病理學(xué)的觀察
　　光鏡下顯示，正常組大鼠腎臟腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)

16、正常，腎間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管無(wú)擴(kuò)張充血;模型組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、系膜細(xì)胞增多;腎小管上皮腫脹，甚至壞死;腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張充血。三黃益腎膠囊低劑量治療組大鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度彌漫性增生，局灶節(jié)段性加重，內(nèi)皮細(xì)胞增生、腫脹，基底膜空泡變性;腎小管上皮空泡及顆粒變性，灶狀萎縮，腎間質(zhì)灶狀淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)，灶狀纖維化，小動(dòng)脈管壁輕度增厚，與模型組比較無(wú)明顯變化。三黃益腎膠囊中、高劑量治療組腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度節(jié)段性

17、增生，上皮細(xì)胞未見(jiàn)著變;腎小管上皮空泡及顆粒變性，未見(jiàn)萎縮，腎間質(zhì)小灶淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)纖維化，小動(dòng)脈管壁未見(jiàn)增厚，但中、高劑量組間比較無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1、三黃益腎膠囊對(duì)紊亂的糖脂代謝無(wú)治療作用。
　　2、三黃益腎膠囊能夠降低血尿素氮、肌酐、血清C反應(yīng)蛋白的水平。
　　3、三黃益腎膠囊能夠抑制MMP-9在腎臟表達(dá)的下降，抑制TNF-α在腎臟的表達(dá)，減輕糖尿病大鼠腎臟的肥大。
　　4、本實(shí)驗(yàn)

18、表明三黃益腎膠囊中、高劑量對(duì)糖尿病腎病有治療作用，而中、高劑量治療結(jié)果組間無(wú)明顯差異，說(shuō)明其治療作用存在劑量依賴(lài)性，但不存在線(xiàn)性關(guān)系，從藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)的角度考量，中劑量為臨床上合適的治療劑量。
　　5、本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的糖尿病大鼠模型8周后血尿素氮、肌酐升高，血清CRP明顯升高，腎臟MMP-9表達(dá)降低，TNF-α表達(dá)升高，但經(jīng)三黃益腎膠囊治療8周后血尿素氮、肌酐明顯下降，腎損害減輕，血清CRP明顯下降，腎臟MMP-9表達(dá)上升，TNF-α表達(dá)