復方中藥合劑抗HCMV感染陽性膠質瘤干細胞作用及機制的研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察該復方中草藥合劑在體外對HCMV感染的U251膠質瘤干細胞（GSCS）增殖及凋亡的影響。
　　2.探討該復方中草藥合劑及聯(lián)合更昔洛韋在體內對HCMV感染的U251GSCS移植瘤的生長及其血管生成的影響。
　　方法：
　　1.根據(jù)莪術、冬凌草、白花蛇舌草抗病毒抗腫瘤特性制備抗膠質瘤復方中草藥配方，將三種中草藥提取物溶于培養(yǎng)基中，制備不同濃度的復方中草藥合劑。
　　2.用HCMV AD169

2、毒株感染人胚肺成纖維細胞（HELF）進行病毒擴增，并用空斑定量法測HCMV滴度。
　　3.用單克隆培養(yǎng)法從U251膠質瘤細胞系中分離出GSCs，用流式細胞儀檢測U251GSCS中CD133+細胞的比例。
　　4. U251GSCS接種HCMV（MOI=1），實驗組加入不同藥物濃度復方中草藥合劑，對照組加入相同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，用MTT法檢測各組細胞活性。
　　5.用RT-PCR檢測各組細胞中HCMV基因IE-

3、1、抑制凋亡基因Bcl-2及促進凋亡基因Bax mRNA的表達，Western blot檢測各組Bcl-2及Bax蛋白表達的情況。
　　6.將感染HCMV的U251GSCS移植到裸鼠顱內14d后，將裸鼠隨機分為復方中草藥合劑組、更昔洛韋組、復方中草藥合劑聯(lián)合更昔洛韋組及空白對照組。采用灌胃給藥的方式治療裸鼠，14天后處死裸鼠，取出腦組織中的腫瘤組織做病理檢查。
　　7.用免疫組化檢測腫瘤中IE-1、CD34蛋白表達，并計算腫

4、瘤微血管密度（MVD），RT-PCR檢測腫瘤中Bcl-2、Bax mRNA的表達。
　　結果：
　　1. U251GSCS在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長，細胞呈球形，流式細胞儀結果顯示，U251GSCS中CD133+細胞數(shù)達95%以上。
　　2. MTT結果顯示，復方中草藥合劑可抑制細胞增殖，隨著復方中草藥合劑濃度及作用時間的增加，HCMV感染的U251GSCS活性降低（P＜0.05）。
　　3.軟瓊脂克隆形成實驗結果

5、表明，該復方中草藥合劑可明顯抑制HCMV感染的U251 GSCS的克隆形成，且隨著藥物濃度的增加，抑制效果越明顯（P＜0.01）。
　　4. RT-PCR結果顯示，HCMV感染的U251GSCS與不同濃度復方中草藥合劑培養(yǎng)48h后，細胞內促凋亡基因Bax mRNA的表達量增加，HCMV基因IE-1和抑凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達量減少（P＜0.05）。
　　5. Western blot結果顯示，HCMV感染的U251

6、GSCS在不同濃度復方中草藥合劑作用48h后，Bax蛋白表達量隨著藥物濃度的增加而增多，而Bcl-2蛋白表達量隨著藥物濃度的增加而減少（P＜0.05）。
　　6.復方中草藥合劑和更昔洛韋均能減少HCMV感染的U251GSCS移植瘤微血管的生成（P＜0.05），聯(lián)合用藥抑制移植瘤微血管生成較單獨用藥組效果明顯，二者無交互作用（P＞0.05）。
　　7. RT-PCR結果顯示，復方中草藥合劑和更昔洛韋能抑制移植瘤細胞內Bcl-2

7、 mRNA的表達（P＜0.05），并促進Bax mRNA的表達（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組Bcl-2 mRNA相對表達量明顯低于復方中藥組、更昔洛韋組和對照組（P＜0.05），聯(lián)合用藥組Bax mRNA相對表達量明顯高于復方中藥組、更昔洛韋組和對照組（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.該復方中草藥合劑在體外能抑制HCMV感染的U251GSCS的增殖并誘導其凋亡。
　　2.該復方中草藥合劑可通過抑制腫瘤血管生成、誘導