慢病毒介導的TSC2表達降低對白血病U937細胞系的影響及作用機制.pdf

1、目的：研究抑癌基因TSC2（Tuberous Sclerosis Complex2）表達降低對白血病U937細胞系的生長、增殖、分化和凋亡的影響及其對 mTORC1(mammalian target of rapamycin，mTOR complex1）通路蛋白激酶及其靶分子活性的影響，揭示急性白血病發(fā)生的新機制。
　　方法：選擇TSC2高表達的U937細胞，通過慢病毒介導的RNA干擾技術下調TSC2基因表達，篩選出GFP陽性率高

2、的細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用CCK-8法和細胞克隆形成能力實驗檢測細胞的增殖活力；用 PI（碘化丙啶）標記流式細胞術檢測細胞周期；用流式細胞儀檢測細胞分化；采用 AnnexinV-PE/7-AAD雙染流式細胞術檢測細胞凋亡；通過蛋白印記實驗，檢測TSC2表達下調對mTORC1信號通路蛋白活性的影響；采用實時定量PCR法檢測TSC2基因低表達對mTORC1通路下游靶基因表達的影響。
　　結果：⑴慢病毒感染U937細胞后，實時定量PC

3、R方法檢測TSC2 mRNA的表達，干擾效率為71.7％；Western blot方法檢測蛋白表達，可見TSC2蛋白的表達量明顯下調。⑵下調TSC2基因表達對U937細胞的生物學作用：CCK-8細胞增殖實驗結果表明， TSC2基因表達下調后，細胞增殖活性增強，與未感染組細胞（空白對照）相比，實驗組增殖活性增強了(5.15±0.72)倍，空載病毒組增殖活性增強了(1.92±0.63)倍，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；細胞克隆

4、形成能力實驗表明，與空載病毒對照組相比，實驗組的細胞集落形成能力明顯增強（P<0.05）；細胞周期實驗結果表明：與空病毒組相比，實驗組細胞G1期比例明顯降低（P<0.05），G2/M期細胞比例增高（P<0.05），S期比例增高（P<0.05）；流式細胞儀檢測細胞分化結果表明，與空載病毒對照組相比，實驗組細胞CD13、CD33、CD11b、CD15、CD14、CD64表達無明顯變化；流式細胞儀檢測細胞凋亡結果表明，TSC2表達降低對細胞凋

5、亡無明顯改變（P>0.05）。⑶TSC2基因表達下調對mTORC1通路蛋白的影響：Western blot方法檢測mTOR及其下游分子的表達結果表明，TSC2表達下調后，mTOR總蛋白未見明顯變化，而磷酸化p-mTOR(Ser2448)表達升高；底物激酶P70S6K和4EBP1總蛋白未見明顯變化，但是活性形式p-P70S6K(Thr389)和p-4EBP1(Thr37/46)的表達明顯升高；AKT總蛋白及活性形式的p-AKT的表達未見明