褪黑素緩解老化卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育受阻的研究.pdf

1、高齡婦女接受體外受精（IVF）治療后的成功率明顯偏低。其中，卵母細(xì)胞老化造成的胚胎發(fā)育能力下降，是導(dǎo)致高齡婦女體外受精后妊娠率低、流產(chǎn)率高的重要原因。因此，尋找能夠緩解老化卵母細(xì)胞 IVF后發(fā)育受阻的方法具有重要的意義。
　　本實(shí)驗(yàn)以過氧化氫（H2O2）處理小鼠卵母細(xì)胞建立的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)老化模型為研究對(duì)象，研究氧化應(yīng)激誘導(dǎo)卵母細(xì)胞老化后線粒體的相關(guān)特征受損與老化卵母細(xì)胞 IVF后胚胎發(fā)育率及質(zhì)量下降的關(guān)系。繼而，以老化卵母細(xì)胞囊胚

2、發(fā)育率和囊胚質(zhì)量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，并輔于線粒體功能狀態(tài)，考察褪黑素改善老化卵母細(xì)胞IVF胚胎發(fā)育率及質(zhì)量的可行性，為提高臨床高齡女性IVF成功率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究分別利用10μM、50μM、100μM和150μM不同濃度的H2O2處理MII期卵母細(xì)胞3 h，建立以氧化應(yīng)激為特征的卵母細(xì)胞老化模型，以未經(jīng)H2O2處理的卵母細(xì)胞為對(duì)照。各組卵母細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的 IVF后，觀察發(fā)育效率。結(jié)果顯示，隨H2O2濃度的增加，卵母細(xì)胞中的氧

3、化應(yīng)激程度是明顯加劇的。經(jīng)150μM H2O2處理的卵母細(xì)胞IVF后，碎裂率相比對(duì)照組顯著性升高（7.77±4.78％vs.39.32±9.14%，P<0.05）；100μM H2O2處理后2細(xì)胞率相比對(duì)照組顯著降低（45.63±2.6%vs.54.67±8.27%，P<0.05）；當(dāng)IVF胚胎發(fā)育至囊胚階段時(shí)，50μM、100μM處理組囊胚率分別為26.27±0.06%、28.46±3.45%，均顯著低于對(duì)照組（34.9±1.77%，

4、P<0.05）。這說明老化卵母細(xì)胞中的氧化應(yīng)激，可能會(huì)對(duì)IVF后胚胎產(chǎn)生持續(xù)的影響，造成發(fā)育損傷。
　　在許多細(xì)胞類型中，老化往往伴隨著明顯的線粒體功能損傷，因此我們對(duì)H2O2誘導(dǎo)卵母細(xì)胞老化的線粒體功能進(jìn)行了專門的檢測(cè)?；钚跃€粒體特異性標(biāo)記探針Mitotracker Red結(jié)果顯示老化卵母細(xì)胞內(nèi)活性線粒體豐度明顯減少；類似地，通過對(duì)線粒體基因組（mtDNA）拷貝數(shù)的絕對(duì)定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著 H2O2處理濃度的升高，卵母細(xì)胞 mtD

5、NA拷貝數(shù)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)；此外，使用JC-1探針對(duì)線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)結(jié)果顯示，10~100μM濃度下表現(xiàn)出MMP升高的趨勢(shì)，即超極化現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是凋亡早期特征性事件，意味著老化卵母細(xì)胞已經(jīng)啟動(dòng)了凋亡的發(fā)生。
　　老化卵母細(xì)胞中氧化應(yīng)激對(duì) IVF胚胎的持續(xù)影響，提示這一過程是可恢復(fù)的。因此，我們嘗試在體外培養(yǎng)階段（IVC）添加褪黑素（MT），通過清除附植前胚胎中的活性氧來緩解老化卵母細(xì)胞IVF后的發(fā)育損傷。選取了較為溫

6、和的100μM H2O2濃度誘導(dǎo)卵母細(xì)胞老化，分別在培養(yǎng)液中添加10-5 M、10-7 M、10-9 M三個(gè)濃度的褪黑素，評(píng)價(jià)老化卵母細(xì)胞IVF后發(fā)育效率和發(fā)育質(zhì)量。結(jié)果顯示，與老化組（20.87±4.11%）相比，培養(yǎng)液中添加10-9 M褪黑素可以顯著恢復(fù)囊胚率（29.42±2.39%），達(dá)到與青年卵相當(dāng)?shù)陌l(fā)育水平（38.76±9.43%）。而10-5 M和10-7 M褪黑素添加則未能改善囊胚率（19.87±2.88%、23.35±6

7、.03%）。這些結(jié)果表明IVF后培養(yǎng)階段添加低濃度的褪黑素可以有效恢復(fù)和改善老化卵母細(xì)胞IVF后的發(fā)育能力。接下來發(fā)現(xiàn)10-5 M、10-7 M、10-9 M褪黑素添加后，囊胚細(xì)胞數(shù)分別為28.30±10.42%、31.54±9.97%、39.36±9.78%，均與 H2O2處理老化組（37.91±4.25%）差異不顯著。進(jìn)一步，囊胚凋亡檢測(cè)結(jié)果提示，10-9 M褪黑素添加有降低老化卵IVF囊胚細(xì)胞凋亡率的趨勢(shì)，但差異不顯著（2.57%

8、 vs.3.18%）。我們意外地發(fā)現(xiàn)，10-5 M褪黑素會(huì)顯著增加囊胚細(xì)胞凋亡率（6.97%vs.3.18%, P<0.05），提示高濃度的褪黑素添加會(huì)有細(xì)胞毒害作用。mtDNA定量結(jié)果顯示，10-9 M褪黑素添加組與H2O2處理老化組相比，能夠顯著恢復(fù)8細(xì)胞階段mtDNA拷貝數(shù)。
　　結(jié)論：
　　1）100μM H2O2誘導(dǎo)卵母細(xì)胞老化，卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體相關(guān)特征受損明顯，其中線粒體中 ROS水平顯著升高，活性線粒體豐度和