式根島海綿宏基因組文庫(kù)活性物質(zhì)研究.pdf

1、海綿是次級(jí)活性代謝產(chǎn)物的豐富和重要來(lái)源。很多海綿次級(jí)代謝產(chǎn)物是由海綿的共生菌產(chǎn)生的。但是，大多數(shù)的海綿微生物在實(shí)驗(yàn)條件下仍然無(wú)法培養(yǎng)。功能宏基因組學(xué)可以不經(jīng)過(guò)任何培養(yǎng)或分離步驟，直接從環(huán)境樣品中提取基因組DNA，來(lái)開(kāi)發(fā)未培養(yǎng)環(huán)境微生物。由于海綿微生物具有化學(xué)和生物多樣性，海綿宏基因組文庫(kù)將是一種很有潛能的資源，可用來(lái)探索獨(dú)特的活性小分子物質(zhì)及其對(duì)應(yīng)的未知功能基因。因此，本論文構(gòu)建了式根島海綿（Discodermia calyx）的宏基因

2、組文庫(kù)，對(duì)其進(jìn)行功能篩選，檢測(cè)到三株不同的活性克隆。對(duì)活性克隆進(jìn)行后續(xù)的化學(xué)和序列信息研究，從液體培養(yǎng)液中鑒定出4個(gè)卟啉類化合物（1-4）及其對(duì)應(yīng)的功能基因，3個(gè)脂肪酸化合物（5-7）及其相關(guān)的功能基因，8個(gè)吲哚類化合物（8-15）；從平板培養(yǎng)（固體培養(yǎng)）提取物中檢測(cè)得到1個(gè)酰胺類化合物（16），分離出11個(gè)環(huán)二肽類化合物（17-27）。主要研究結(jié)果如下：
　?、俪晒⒘耸礁鶏u海綿宏基因組文庫(kù)，并從中得到3株不同的陽(yáng)性克?。嚎瓜?/p>

3、狀芽孢桿菌（B. cereus）活性克隆pDC113，棕紅色克隆pDC112和pDC114。
　?、趶淖丶t色克隆pDC112和pDC114檢測(cè)分離到四個(gè)紅色色素：糞卟啉III鋅螯合物（1）、糞卟啉III（2）、原卟啉IX鋅螯合物（3）和原卟啉（4）。其中1是主要色素，其結(jié)構(gòu)由1H NMR，13C NMR，1H-1H COSY，HMQC，HMBC，HRMS，UV數(shù)據(jù)確定。對(duì)克隆pDC112的插入DNA序列進(jìn)行測(cè)定分析，鑒定出由40.

4、639 kb基因編碼的31個(gè)假定的開(kāi)放閱讀框（ORF）。其中4個(gè)ORFs參與卟啉類化合物生物合成：細(xì)胞色素c型生源蛋白（261 aa），谷酰胺tRNA還原酶（hemA，420 aa），膽色素原脫氨酶（hemC，322 aa）和膽色素原合酶（hemB，322 aa）。pDC114的序列分析結(jié)果表明，其37.753 kb序列編碼的32個(gè)假定ORFs中，含有5個(gè)ORFs編碼的蛋白與卟啉類化合物C5生物合成途徑中形成線狀或環(huán)狀四吡咯的必需酶有很

5、近的同源關(guān)系：前咕啉-4C（11）-甲基轉(zhuǎn)移酶（175 aa），鈷胺生物合成酶（391 aa），前咕啉-3B甲基酶（358 aa），hemA（463 aa），谷氨酸-1-半醛2，1-氨基變位酶（hemL，428 aa）。hemA基因同時(shí)存在這2個(gè)克隆中，說(shuō)明hemA可能是合成卟啉類化合物的一個(gè)必需的基因。卟啉類衍生物具有重要的醫(yī)藥和食療價(jià)值，為了工程上使用E. coli生產(chǎn)卟啉類化合物及其衍生生物，從式根島海綿繼續(xù)開(kāi)發(fā)其獨(dú)特的生物合成酶

6、基因，是有價(jià)值的。
　?、蹚目咕寺DC113的異源表達(dá)培養(yǎng)液中分離檢測(cè)到3個(gè)β-羥基脂肪酸：3-羥基棕櫚酸（5），3-羥基肉豆蔻酸（6）和3-羥基月桂酸（7）。5具有中等程度的抗菌活性（MIC，μg/mL）：B. cereus（6.25）和白色念珠菌（C. albicans，12.5）。對(duì)pDC113的插入DNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明其43.32 kb序列編碼42個(gè)假定的ORFs。其中23個(gè)假定的ORFs（共24.813 kb

7、）編碼的蛋白參與脂肪酸和脂質(zhì)A的生物合成，與細(xì)菌脂肪酸Ⅱ類合成酶和脂質(zhì)A生物合成酶有很近的同源關(guān)系。6個(gè)ORFs編碼的蛋白：脂肪酸/磷脂合成蛋白（plsX，376 aa）、ACP S-丙二酰轉(zhuǎn)移酶（fabD314 aa）、fabG（253 aa）、酰基載體蛋白質(zhì)（ACP，81 aa）、b-酮脂酰-ACP合成酶II（fabF，417 aa）和b-羥基酰基-ACP脫水酶（fabZ，179 aa），參與細(xì)菌Ⅱ型脂肪酸的生物合成。7個(gè)ORFs編

8、碼的蛋白：LpxD（344 aa）、LpxA（269 aa）、LpxB（391 aa）、KdtA（434 aa）、LpxK（379 aa）、LpxL（285 aa）和LpxM（285 aa），參與脂質(zhì)A的生物合成。23個(gè)ORFs中的其它ORFs可能是參與脂質(zhì)A生物合成的跨膜蛋白。脂肪酸和脂質(zhì) A的生物合成途徑是抗微生物藥物，尤其是抗耐藥性細(xì)菌藥物研發(fā)的很有吸引力的潛在靶點(diǎn)。海綿微生物及其有趣的基因?qū)⑹沁@些藥物靶點(diǎn)的獨(dú)特來(lái)源。
　　

9、④從抗菌克隆pDC113的液體培養(yǎng)提取物的其它活性部位，還分離得到7個(gè)吲哚類化合物（8-14），其中12具有很強(qiáng)的抗菌活性。通過(guò)對(duì)克隆pDC113的序列分析，并沒(méi)有明顯發(fā)現(xiàn)它們的功能基因信息。在培養(yǎng)液中加入色胺培養(yǎng)pDC113，以檢測(cè)化合物8的產(chǎn)量是否顯著提高時(shí)，意外得到一個(gè)新的吲哚三聚體化合物15，并且活性（MIC，μg/mL）很好：對(duì)B. cereus（<0.78），MSSA（<0.78），C. albicans（6.25）和E.

10、coli（25）都具有抗菌活性，并對(duì)小鼠白血病P388具有細(xì)胞毒性（IC50，1.52μg/mL）。
　?、荼緦?shí)驗(yàn)也嘗試了平板培養(yǎng)活性克隆pDC112和pDC113，得到與液體培養(yǎng)不同的化合物。從克隆pDC112的平板培養(yǎng)提取物的活性部位中檢測(cè)到一個(gè)克隆特異性酰胺類化合物16，由于其量少且不穩(wěn)定，只確定了部分結(jié)構(gòu)。從抗菌克隆pDC113的平板培養(yǎng)提取物的活性部位分離鑒定出11個(gè)環(huán)二肽類化合物（17-27）。據(jù)目前所知，這些環(huán)二肽化

11、合物是首次從宏基因組文庫(kù)分離出來(lái)。對(duì)pDC113的序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明分離的環(huán)二肽類化合物的合成不是通過(guò)非核糖體肽類合成酶（NRPS）的途徑，也不同于已知的環(huán)肽類合成酶（CDPSs）的途徑。其很大可能是通過(guò)新的基因編碼的新的酶生物合成的。這一結(jié)果證明了宏基因組最吸引人的一個(gè)理論潛能：提高發(fā)現(xiàn)新基因的機(jī)會(huì)。
　　本研究對(duì)式根島海綿宏基因組文庫(kù)進(jìn)行功能篩選，成功地分離鑒定出27個(gè)活性化合物及化合物1-7的有意思的功能基因。研究表明，