大鼠SNAT1中二硫鍵數(shù)量和位置的初探.pdf

1、本文對(duì)大鼠SNAT1中二硫鍵數(shù)量和位置進(jìn)行了研究。中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(SNAT1)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于SLC38家族。SNAT1含有十一個(gè)跨膜區(qū)域，在轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的同時(shí)協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)一個(gè)Na+，參與機(jī)體的很多重要生理活動(dòng)，主要介導(dǎo)谷氨酰胺從星形膠質(zhì)細(xì)胞到神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。它的功能紊亂會(huì)導(dǎo)致許多神經(jīng)退行性疾病。為了進(jìn)一步研究SNAT1的結(jié)構(gòu)和功能，我們通過PCR，酶切，連接的方法分別將HA抗體標(biāo)簽與SNAT1 C端相連

2、，EGFP抗體標(biāo)簽與SNAT1 C端相連，并將融合蛋白構(gòu)建在真核細(xì)胞表達(dá)載體pBK－CMV(△[1098－1300])上，獲得質(zhì)粒pBK－CMV△-SNAT1－HA和pBK－CMV△－SNAT1－EGFP，在此基礎(chǔ)上可通過激光共聚焦電子顯微鏡(LCM)觀察以及生物素標(biāo)記分析可確定SNAT1定位在細(xì)胞膜上，并可通過Western Blot檢測(cè)SNAT1及其突變型在細(xì)胞中的表達(dá)量。SNAT1中含有10個(gè)半胱氨酸(Cys)，我們使用Pfu酶對(duì)

3、這十個(gè)Cys分別進(jìn)行C-A(丙氨酸，Ala)定點(diǎn)突變。將各種突變型轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)各單C－A突變型對(duì)SNAT1的表達(dá)基本沒有影響，但是C477對(duì)SNAT1在細(xì)胞膜上的定位可能有一定影響。mPEG5000-mal可以與巰基發(fā)生偶合。Western Blot結(jié)果顯示，只用mPEG5000-mal修飾的SNAT1條帶明顯低于用DTT處理后再用mPEG5000-mal修飾的條帶。用IA修飾SNAT1之后，除去IA再用DTT處理并用m

4、PEG5000-mal修飾，條帶顯著高于只用IA修飾的SNAT1，由此說明SNAT1中存在二硫鍵。對(duì)野生型和十種突變型SNAT1進(jìn)行直接的mPEG5000-mal修飾，將條帶進(jìn)行對(duì)比可以估測(cè)野生型SNAT1被修飾上7個(gè)mPEG5000-mal，C245A和C262A突變型被修飾上8個(gè)mPEG5000-mal，C389A突變型被修飾上7個(gè)mPEG5000-mal，其他7種突變型均被修飾上6個(gè)mPEG5000-mal，由此推測(cè)，SNAT1中