海洋產(chǎn)黑色素短梗霉P16菌株產(chǎn)普魯蘭多糖的研究.pdf

1、普魯蘭多糖是一種線性葡聚糖，由重復的麥芽三糖單位經(jīng)α-1，6糖苷鍵連接而成，是由短梗霉產(chǎn)生的水溶性同型胞外多糖，普魯蘭多糖中α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵相互交替，使其具有結構上的彈性和較強的水溶性。普魯蘭多糖在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及化妝品等行業(yè)具有廣泛的應用潛力。
　　對100多株分離自紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的短梗霉菌株產(chǎn)胞外多糖能力進行篩選后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黑色素短梗霉P16菌株產(chǎn)胞外多糖的能力最高。P16菌株產(chǎn)胞外多糖最適培養(yǎng)基中的碳源和

2、氮源分別為120 g/l蔗糖和3 g/l酵母粉。在搖瓶培養(yǎng)條件下，120小時內(nèi)胞外多糖濃度達65.3±2.1g/l，細胞干重達18.7±0.38 g/l。10-1發(fā)酵罐分批發(fā)酵120小時，胞外多糖濃度達67.4±4.5g/l，菌體量達23.01±0.12g/l,總糖剩余1.1％，還原糖剩余0.078％，并且發(fā)酵過程中不產(chǎn)黑色素。P16菌株所產(chǎn)的胞外多糖經(jīng)過純化后，可以被普魯蘭酶有效地水解;紅外光譜檢測分析發(fā)現(xiàn)，純化的胞外多糖與普魯蘭多糖

3、標準品的峰型一致，說明P16菌株所產(chǎn)的胞外多糖為普魯蘭多糖。這是對分離自紅樹林生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)黑色素短梗霉高產(chǎn)普魯蘭多糖的首次報道。
　　在接下來的研究中，為了有效轉化菊粉生產(chǎn)普魯蘭多糖，在P16菌株中高效表達了Kluyveromyces maximum KM菌株的INU1基因，通過對不同重組菌株利用菊粉產(chǎn)普魯蘭多糖能力的測定，發(fā)現(xiàn)重組菌株EI36的菊粉酶酶活達40.92±1.08 U/ml，而原始菌株P16的菊粉酶酶活僅為7.57±0

4、.29 U/ml:重組菌株EI36所產(chǎn)的菊粉酶大部分(99.27％)分泌到培養(yǎng)基中。利用含140 g/l菊粉的發(fā)酵培養(yǎng)基進行10-1發(fā)酵罐分批發(fā)酵，108小時內(nèi)，普魯蘭多糖濃度達70.57±1.3 g/l，菊粉酶活力于60小時達到最高，為42.03 U/ml，培養(yǎng)基中的菊粉被EI36菌株所產(chǎn)的菊粉酶有效地水解，大部分的還原糖被EI36菌株用于普魯蘭多糖的生產(chǎn)。P16菌株經(jīng)過以上的遺傳改造后，可以直接利用菊粉生產(chǎn)普魯蘭多糖。
　　普

5、魯蘭多糖合成酶基因PUL1與普魯蘭多糖的生物合成相關，對P16菌株中PUL1基因進行克隆及特征分析后發(fā)現(xiàn)，PUL1基因的ORF長592 bp，編碼178個氨基酸，含有1段長55 bp的內(nèi)含子。PUL1基因的啟動子中含有1個CAAT box，1個TATA box和1段5'-HGATAR-3'序列，該基因編碼的蛋白含有1段長18個氨基酸的信號肽，5個N-糖基化位點。對PUL1基因進行敲除后，發(fā)現(xiàn)敲除菌株DP108的普魯蘭多糖產(chǎn)量顯著下降，為

6、34.66±0.34g/l，說明PUL1基因與普魯蘭多糖的合成相關。GFP-PUL1融合蛋白表達后，位于酵母細胞中的液泡表面，說明普魯蘭多糖的生物合成發(fā)生在酵母細胞的胞質(zhì)中。在P16菌株中超表達了PUL1基因后，發(fā)現(xiàn)重組菌株G14所產(chǎn)的普魯蘭多糖濃度超過72.0 g/1，而原始菌株P16在相同條件下的普魯蘭多糖濃度為67.4 g/l，說明普魯蘭多糖的產(chǎn)量由于普魯蘭合成酶基因的超表達而提高。純化后的普魯蘭多糖分子量為4.422×105g/